2023年10月17日
理化研究所 东京药科大学 横滨市立大学
-发现用于癌症控制的药物靶点口袋-
理化学研究所(理研)生命功能科学研究中心表观遗传控制研究小组(研究当时)的梅原崇史小组组长(研究当时，现创药蛋白质分析基础单元高级研究员)、菊地正树研究员(研究当时，现生命医科学研究中心免疫器官形成研究小组研究员)、 环境资源科学研究中心化学基因组学研究组客座主管研究员伊藤昭博(东京药科大学生命科学部教授)、横滨市立大学研究生院生命医科学研究科结构表基因组科学研究室的小沼刚助教等共同研究组发现，在多种类型的癌细胞中高表达的蛋白质GAS41[1]， 认识到负责后成遗传信息[2] (表观信息)的组蛋白H3蛋白的乙酰化修饰[3]，发现了激活特定基因表达的结构。 根据本研究成果，期待合理开发抑制GAS41高表达的多种癌细胞增殖的调控分子。 以人为首的真核细胞[4]的基因组DNA形成核小体[5]的结构并凝聚而成，表基因组[2]控制着哪个基因的核小体在转录[6]之前被解开。 这次，联合研究小组用结构、生物、生物、化学、细胞生物学的方法分析了GAS41的结构和功能。 结果，GAS41蛋白质利用不同口袋识别组蛋白H3的" n末端[7] "和"从n末端数第14个或第27个蓖麻毒素残基[8]的乙酰化修饰"，通过促进H2A.Z这一组蛋白的变种蛋白质导入核小体，使特定的基因容易转录的结构已经变得清晰起来。本研究刊登在科学杂志《proceedings of the national academy of sciences ( PNAS )》在线版( 10月16日)上。
已知后成遗传信息与从表基因组转录的基因的质和量的控制有关。 在众多已知的后成遗传信息中，组蛋白的乙酰化修饰在活化多细胞生物各自细胞种类中特异性表达的基因转录方面被认为是重要的。 近年来，有研究表明，核酸酶内部组蛋白中蓖麻毒素残基的乙酰化以怎样的顺序传播，激活基因转录的机制，以及组蛋白特定蓖麻毒素残基的乙酰化激活了从表基因组转录基因的哪个反应素过程等，这一点已经得到了证实(注1，2 )。组蛋白乙酰化修饰引起基因转录激活的机制有多种。 作为重要的调控途径，已知有识别乙酰化的组蛋白的种类和蓖麻毒素残基的位置的“读者”蛋白质参与的途径。 对于组蛋白的乙酰化修饰，已知具有溴结构域[9]和YEATS结构域[1]的蛋白质是主要的“读者”蛋白质，已知在细胞内这些蛋白质的表达亢进会导致癌症和炎症等疾病。 关于溴结构域识别组蛋白乙酰化修饰的结构，分析正在进行中，选择性阻碍具有特定溴结构域的蛋白质功能的化合物的开发和利用该化合物的癌症控制机制的研究正在进行中(注3，4 )。 另一方面，关于YEATS结构域识别组蛋白乙酰化修饰的机制还有很多不清楚的地方，YEATS结构域的抑制剂的开发也处于滞后的状况。 因此，联合研究小组着眼于人类中存在的4种含YEATS结构域的蛋白质中，在难治性癌的一种胶质母瘤细胞[10]中能看到基因扩增的GAS41。 GAS41是控制真核生物种间保存的染色质[5]结构的蛋白质复合体的构成成分之一，通过改变染色质的结构活化基因的转录。 GAS41的基因不仅在胶质瘤细胞中，在胃癌、肝癌、直肠癌、胰腺癌、乳腺癌和肺癌的细胞中也有过度表达，近年来已知在细胞内减弱GAS41基因的表达可以减轻这种致癌。 GAS41的致癌活性与GAS41的YEATS结构域识别组蛋白的乙酰化修饰有关，但其识别由什么样的机制承担还不清楚。 因此，本研究的目标是阐明GAS41通过YEATS结构域是如何识别组蛋白的特定乙酰化状态并在细胞内发挥作用的机制。
注1）2023年7月17日プレスリリース「遺伝子発現を制御するエピゲノムの複製と転写」
注2）2020年11月26日プレスリリース「エピゲノムの制御を受けた転写の方程式」
注3）2018年8月8日プレスリリース「『がんエピゲノム』を検出する新手法」
注4）2023年10月3日プレスリリース「遺伝子発現を活性化するスーパーエンハンサーの再定義」
联合研究小组首先就GAS41的YEATS结构域能识别组蛋白的什么样的乙酰化状态，通过改变组蛋白的种类、乙酰化修饰在n末端尾部的位置、n末端尾部的长度进行了生化比较研究。 结果表明，GAS41的YEATS结构域与从组蛋白H3的n末端数第14个蓖麻毒素残基的乙酰化( K14ac )结合最强，而且在该结合中组蛋白H3的n末端第1~6个氨基酸残基是不可缺少的。 通常，“读者”蛋白质能识别含有特定化学修饰的氨基酸残基及其前后几个残基的氨基酸序列。 此次数据提示，GAS41的YEATS结构域具有以某种方式识别组蛋白H3的“n末端”和“K14ac”这两个分离位置的结构。 因此，接下来用x射线对含有K14ac的组蛋白H3的n末端尾部区域与GAS41的YEATS结构域的复合体的结晶进行了结构分析。 结果，具有“阅读”蓖麻乙酰化功能的GAS41的YEATS结构域确实与乙酰化的组蛋白H3尾的K14ac及其周边的氨基酸序列结合(图1，左端面板)。 这个结合由YEATS域形成的被称为芳香族笼的口袋承担。
图1 GAS41识别组蛋白H3的n末端尾的两种机制
左侧面板:左侧3个面板中的中间面板显示了GAS41的YEATS结构域和组蛋白H3肽复合体的整体晶体结构，左右面板显示了2个结合位点的放大图。 组蛋白H3的肽用紫色棒表示，GAS41的YEATS结构域用米色表示。 各残基的位置用氨基酸的种类( 1文字表记)和残基的位置(数字)的标签表示。 右端面板: GAS41的YEATS域的分子表面模型。 用绿色到白色的渐变表示分子表面的疏水性程度。 更白色的分子表面更疏水。 组蛋白H3的n -末端尾的第1个丙氨酸( A1 )到第3个苏氨酸( T3 )的氨基酸残基被GAS41的YEATS域的凹陷( H3NT口袋)识别。
此外，发现GAS41的YEATS结构域在远离该芳香族笼结合位点的地方与上述不同的组蛋白H3-tile的n末端区域结合(图1，左起第2和第3个面板)。 在该第二结合位点，我们发现YEATS结构域的疏水分子表面凹陷(命名为H3NT口袋)识别了H3尾部n末端第1~3个3残基(图1，右端面板)。 由于x射线晶体结构分析是将蛋白质结晶化(固体化)进行分析，因此得到的结构可能无法反映生理状况。 在这次的分析中，也有必要验证一下在一个GAS41蛋白质上结合了两个组蛋白H3蛋白质的结构，这实际上是否是水溶液中或细胞内的样子。 因此，接下来，通过NMR方法[11]研究了GAS41的YEATS结构域在水溶液中是如何与组蛋白H3提尔相互作用的。 结果，当组蛋白H3 -尾的第14位蓖麻毒素( K14ac )和第27位蓖麻毒素( K27ac )被乙酰化时，我们发现GAS41的YEATS结构域通过位于芳香笼和H3NT口袋之间的氨基酸(第115个酪氨酸残基: Y115 )与H3肽相互作用(图2 )。该结果提示，GAS41的YEATS结构域是通过两个口袋同时识别水溶液中一条H3提尔的两个不同位点的双价识别模型。 另外，在培养细胞中表达使H3NT口袋变异的蛋白质的实验结果也表明，在晶体结构中观察到的GAS41的H3NT口袋和组蛋白H3的n末端的相互作用也发生在细胞内(图3A )。
图2水溶液中GAS41与组蛋白H3的n末端尾部相互作用的部位
( a )溶液NMR对ga s41 Yeats结构域残基的化学位移的比较。 显示无修饰H3肽(上)、K14乙酰化H3肽(中)、K27乙酰化H3肽(下)滴定前后信号的变化。 y轴的CSD表示化学位移的差分。 表明CSD变化较大的氨基酸残基与滴定的各H3肽的相互作用较强。 平行于x轴的2种虚线是检定相互作用显着差异的标准，上面表示平均值加上2标准偏差，下面表示平均值加上1标准偏差的值。 在各数据的右侧用颜色将与各肽有意义相互作用的残基映射到GAS41的YEATS域表面，用标签表示残基编号。 芳香族笼子的位置用紫色圆圈表示，H3NT口袋的位置用白色圆圈表示。 ( b ) GAS41的YEATS结构域表面结构中第115位酪氨酸残基的位置(黄色)。 两条K14乙酰化H3肽的实际结构(紫色实线)模式地用虚线连接。 用标签表示与芳香族笼结合的H3肽的第12个甘氨酸残基( H3G12 )和与H3NT口袋结合的H3肽的第3个苏氨酸残基( H3T3 )的位置。 在a的分析中，如果H3 -肽被乙酰化，则位于两个残基之间的第115位酪氨酸残基( Y115 )上检测到有意义的化学位移变化，因此在水溶液中，提示GAS41的YEATS结构域在2处不同口袋中( =2价)识别出1根H3提尔。
图3 GAS41对组蛋白H3的n末端识别对细胞内功能很重要
( a ) GAS41与组蛋白H3在细胞内的结合评估。 在细胞内表达GAS41野生型( WT )或两种功能变异体( W93A或E109A )和为了研究全长的组蛋白H3或n末端识别的意义而缺失了第1个丙氨酸残基( A1 )的组蛋白H3，在细胞内进行两种蛋白质间的相互作用 W93A表示YEATS结构域芳香笼的功能突变体，E109A表示YEATS结构域H3NT口袋功能突变体的GAS41。 数据为3次独立实验的平均±标准误差。 用*或***表示Holm检验的统计意义。 ( b ) GAS41和H2A.Z蛋白在导入野生型或突变体GAS41的GAS41表达抑制细胞中的免疫印迹分析。 shCntl表示对照实验，shGAS41表示抑制GAS41表达的实验( +表示处理，-表示未处理)。 可以看出，在功能突变体中，H2A.Z曲线的浓度与GAS41曲线的浓度之比降低，H2A.Z蛋白质的量减少。 ( c )在导入了野生型或变异型GAS41的GAS41表达抑制细胞中，用GAS41靶基因启动子的染色质免疫沉淀-定量实时PCR(ChIP-qPCR )的分析结果。 染色质免疫沉淀( ChIP )是将细胞染色质碎片化，获取含有特定抗体识别的蛋白质及其化学修饰状态的染色质片段的方法。 定量实时PCR(qPCR )是能够推测测定试样中所含DNA量的DNA扩增法。 通过组合这两种方法，可以测定染色质特定区域中含有的蛋白质及其修饰状态的量(染色质中的占有率)。 该ChIP-qPCR分析用抗体检测了组蛋白H2A.Z蛋白的占有率。 各GAS41靶基因如下部所示。 数据为3次独立实验的平均±标准差。 用*或**表示Welch双侧t检验的统计显著性。
作为GAS41的功能，已知通过促进组蛋白的变种蛋白质H2A.Z蛋白质导入核小体，使特定的基因容易转录。 接下来，为了确认GAS41和组蛋白H3的相互作用对于GAS41的细胞功能是否是必要的，我们调查了GAS41对H2A.Z蛋白的量的调控的影响。 使用由于抑制GAS41的基因表达而导致H2A.Z的量减少的细胞，使之变异了野生型GAS41、H3NT口袋或芳香族笼的GAS41进行表达的结果，发现在表达了变异体的细胞中H2A.Z蛋白质的量减少( ) 因此，我们发现GAS41的H3NT口袋和芳香族笼对于在细胞中维持H2A.Z蛋白的量很重要。 GAS41是调控染色质结构的蛋白质复合物的组成成分之一，通过促进H2A.Z向特定基因启动子[12]区域的核小体导入来改变染色质的结构，活化其基因转录。 最后，我们调查了GAS41作为目标的基因启动子上的H2A.Z在染色质中的占有率(图3C )。 选择迄今已知的6种基因启动子作为GAS41的靶，研究了在细胞中表达GAS41的野生型或H3NT口袋或芳香族笼的突变体并与这些基因启动子结合的组蛋白H2A.Z的量。 结果，在所有这6种基因启动子中，表达各自变异体的细胞中H2A.Z在染色质中的占有率明显降低。 这些结果提示，GAS41不仅通过芳香族笼识别组蛋白H3的乙酰化状态，还通过H3NT口袋识别组蛋白H3的n末端，由此精密识别目标基因的启动子，提示了其有助于基因转录活化的机制(图4 )。
图4 GAS41调控表基因组的机制及其在制药中的应用
左图示意性地示出了GAS41进行表基因组控制的结构。 GAS41是组成称为SRCAP或Tip60/p400的蛋白质复合体的蛋白质，同时识别构成核小体的组蛋白H3的n末端尾的n末端(如NT所示)和K14ac或K14ac (如KAC所示)。 由此，含有GAS41二聚体的SRCAP复合体或Tip60/p400复合体正确识别特定基因启动子的核酸酶的乙酰化状态，通过向该核酸酶中促进导入组蛋白H2A.Z而使特定基因的转录开始反应活化时 右图显示了这次发现的GAS41的H3NT口袋的结构信息有助于抗癌控制分子合理开发的形象。
由于在很多癌细胞和炎症细胞等中可以看到组蛋白乙酰化状态的异常，组蛋白脱乙酰酶的抑制剂作为治疗难治性癌症的治疗药物已经实用化。 关于阻碍组蛋白乙酰化识别的化合物，也开发出了很多对溴域的抑制剂具有优异亲和性和选择性的化合物，针对众多癌症种类的临床试验正在进行中。 另一方面，对YEATS结构域的抑制剂的开发还没有溴结构域抑制剂那么先进，特别是对GAS41的抑制剂的开发进展缓慢。 此次研究发现，GAS41的YEATS结构域中存在其他蛋白质YEATS结构域中看不到的功能口袋。 众所周知，GAS41的表达不仅在胶质瘤细胞中，在胃癌细胞和肺癌细胞等中也有异常。 今后，通过活用这次明确的结构信息，可以期待合理开发面向癌症控制的选择性阻碍GAS41的化合物。
1.GAS41，年域 GAS41 (胶质母瘤扩增序列41 )是识别组蛋白H3的n末端尾的化学修饰的蛋白质，在人类中全长由227个氨基酸组成。 分子内具有被称为YEATS域和线圈域的2种域。 YEATS结构域是由120~140个氨基酸构成的结构域，具有识别组蛋白蓖麻毒素残基的乙酰化修饰和酰化修饰的作用。 线圈结构域具有通过线圈结构域相互作用形成蛋白质二聚体的作用。 2 .后成遗传信息，表基因组 细胞内的DNA中将遗传信息作为碱基序列记录下来。 在细胞中，除了DNA的碱基序列以外，还存在着记忆细胞个性的各个信息，这些作为对DNA和组蛋白等的化学修饰被记录下来。 记录在该DNA周边的DNA碱基序列以外的生命信息称为后成遗传信息(表观遗传信息)。 “基因组”是指以细胞内所有DNA的碱基序列记录的遗传信息的总体，而“表基因组”是指包含通过DNA和组蛋白等化学修饰而存储细胞个性的信息的总体。 3 .组蛋白H3蛋白乙酰化修饰 被称为组蛋白的蛋白质通过缠绕DNA，具有将长大的DNA收纳在核内的作用。 组蛋白为了缠绕DNA，形成了由两个组蛋白H3和H4各聚集的H3-H4四聚体和两个组蛋白H2A和H2B各聚集的H2A-H2B二聚体组成的组蛋白八聚体。 组蛋白被保存得超过了生物种间，特定的氨基酸残基被化学修饰的例子广为人知。 在代表性化学修饰乙酰化修饰的情况下，乙酰基( CH3CO-)与蛋白质蓖麻毒素残基的侧链胺结合。 组蛋白H3的情况下，从n末端的第1个残基开始数，第4个、第9个、第14个、第18个、第23个、第27个、第36个等蓖麻毒素残基被乙酰化酶乙酰化，其中大多数与基因转录的激活状态相关。 4 .真核细胞 真核细胞是指具有核膜包裹的核或其他小器官的细胞。 真核细胞的基因组DNA形成以核小体为基本单位的凝聚结构，在占细胞周期大部分的期中以收纳在细胞核中的状态存在。 作为由真核细胞构成的真核生物的代表性生物，可以举出由单细胞构成的酵母、由多细胞构成的昆虫、老鼠、人等。 5 .核小体、染色质 在真核细胞核内由DNA和组蛋白八聚体(各含两个H2A、H2B、H3、H4蛋白质的复合体)周期性缠绕形成的复合体称为核小体。 核小体的中心部分由145~147个碱基对的DNA缠绕在组蛋白八聚体上的核心粒子组成。 由长链DNA和多个核小体构成的串珠状结构体被称为染色质。 6 .转录 RNA聚合酶读取基因DNA的碱基序列，合成与双链DNA的一个碱基序列相对应的RNA的反应称为“转录”。 RNA聚合酶是以DNA为模板聚合构成RNA的基本单元核糖核苷酸的酶，原核生物中存在1种RNA聚合酶，真核生物中存在RNA聚合酶ⅰ、ⅱ、ⅲ3种。 大多数基因只在其主体部分不发生转录，而需要在基因的上游或下游有能使转录反应发生质的和量的变化的DNA序列。 它们根据其位置和功能被称为启动子和增强子。 7.N末端 蛋白质由氨基酸残基呈直链状连接的多肽构成，因此有其开始和结束。 蛋白质起始的第一个残基(或其主链氨基)称为n末端，蛋白质终止的最后一个残基(或其主链羧基)称为c末端。 有些蛋白质的n -末端残基的氨基在细胞内受到乙酰化修饰，而组蛋白H3的n -末端残基的氨基没有受到化学修饰。 另外，组蛋白的n末端残基之后的数十个残基的区域作为不具有特定结构的尾部在水溶液中发生了波动。 组蛋白n -末端尾的蓖麻毒素残基侧链的氨基容易受到乙酰化和甲基化等化学修饰，其特定的修饰状态与基因表达的激活和抑制化的状态相关。 8 .蓖麻毒素残基 构成蛋白质的氨基酸之一。 1个字符简称为k。 因为侧链带有氨基，所以作为蛋白质中的残基成为对氨基进行乙酰化和甲基化修饰的目标。 9 .溴域 110~120氨基酸组成的蛋白质折叠结构。 在该折叠结构的中心部分具有凹陷，通过该凹陷可以特异性识别存在于组蛋白的n -末端尾部等处的蓖麻毒素残基的乙酰化状态。 10 .胶质瘤细胞 大脑中产生的恶性度高的肿瘤的一种。 11.NMR法 这是一种在高磁场环境下对分子(蛋白质等)照射电磁波，通过观测构成分子的原子的各个原子核根据周边的化学环境吸收特定电磁波的共振现象来推测分子的立体结构及其变化的方法。 即使原子核种类相同，共振频率也会根据原子核周边环境的不同而变化，得到关于被称为化学位移的分子立体结构的信息。 12 .基因启动子 在DNA上开始转录基因( RNA )的位置附近，具有表达基因功能的碱基序列。 人们认为，通过基因启动子与众多基本转录因子和RNA聚合酶结合，可以决定特定基因的转录位置和转录量。
理化研究所 生命功能科学研究中心 表观遗传学控制研究小组(研究当时) 团队领导(研究当时)梅原崇史 (现创药蛋白质分析基础单元高级研究员) 研究员(研究当时)菊地正树 (现生命医学科学研究中心免疫器官形成研究小组研究员) 环境资源科学研究中心 化学基因组学研究组 客座主管研究员伊藤昭博 (东京药科大学生命科学部教授) 东京药科大学 生命科学部细胞信息科学研究室 特别研究员( PD ) (研究当时)高濑翔平 研究员则次恒太 硕士课程2年级(研究当时)关根咲彩 横滨市立大学 研究生生命医科研科结构表基因组科学研究室 助教小沼刚 教授池上贵久
本研究由理化学研究所运营费补助金(生命功能科学研究)实施，科学技术振兴机构( JST )战略性创造研究推进事业个人型研究( PRESTO、 先驱)“细胞功能的构成性理解和调控(研究领域总结:上田泰己)”的研究课题“'表核苷酸’的精密重构引起的基因表达调控分析(研究代表者:梅原崇史)”、 日本学术振兴会( JSPS )科学研究费资助事业学术变革领域研究( a )“从DNA物性理解的基因组模态(领域代表者:西山朋子)”，同基础研究( b )“操作在癌细胞中顽强维持的超乙酰化表基因组(研究代表者:梅原崇史)”该青年研究“阐明GAS41对乙酰化核酸酶识别机制(研究代表者:菊地正树)”等的资助下进行。
Masaki Kikuchi, Shohei Takase, Tsuyoshi Konuma, Kota Noritsugu, Saaya Sekine, Takahisa Ikegami, Akihiro Ito, and Takashi Umehara*, "GAS41 promotes H2A.Z deposition through recognition of the N terminus of histone H3 by the YEATS domain", Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America（PNAS）, 10.1073/pnas.2304103120
理化研究所 生命功能科学研究中心表观遗传学控制研究小组(研究当时) 团队领导(研究当时)梅原崇史 (现创药蛋白质分析基础单元高级研究员) 研究员(研究当时)菊地正树 (现生命医学科学研究中心免疫器官形成研究小组研究员) 环境资源科学研究中心化学基因组学研究组 客座主管研究员伊藤昭博 (东京药科大学生命科学部教授) 横滨市立大学 研究生生命医科研科结构表基因组科学研究室 助教小沼刚
理化研究所宣传室新闻发言人
东京药科大学总务部宣传科 Tel: 042-676-6711 Email: kouhouka [at] toyaku.ac.jp 横滨市立大学宣传课长上村一太郎 Tel: 045-787-2414 email:koho [ at ] yokohama-Cu.AC.jp ※请将上述[at]替换为@。
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