层析术语汇总

1.常用的层析技术介绍2.抗体药物下游纯化常用的层析技术

3.层析术语基本知识

01-层析相关体积、02-分辨率、03-选择性和有效性、04-柱效、05-线性流速和体积流速、06-固定相和流动相、07-载量1 

1.常用的层析技术介绍

A：如下

♀ 凝胶过滤层析 凝胶过滤层析法又称为排阻层析或分子筛方法，主要是根据蛋白质的大小和形状，即蛋白质的质量进行分离和纯化。层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质，多是交联的聚糖（如葡聚糖或琼脂糖）类物质，使蛋白质混合物中的物质按分子大小的不同进行分离。也叫做分子排阻层析。一种利用带孔凝胶珠作基质，按照分子大小分离蛋白质或其它分子混合物的层析技术。一般是大分子先流出来，小分子后流出来。

♀ 亲和层析 亲和色谱也称为亲和层析，是一种利用固定相的结合特性来分离分子的色谱方法。亲和色谱在凝胶过滤色谱柱上连接与待分离的物质有一定结合能力的分子，并且它们的结合是可逆的，在改变流动相条件时二者还能相互分离。亲和色谱可以用来从混合物中纯化或浓缩某一分子，也可以用来去除或减少混合物中某一分子的含量。

♀ 离子交换层析 离子交换层析分离蛋白质是根据在一定pH 条件下，蛋白质所带电荷不同而进行的分离方法。常用于蛋白质分离的离子交换剂有弱酸型的羧甲基纤维素(CM纤维素) 和弱碱型的二乙基氨基乙基纤维素(DEAE纤维素)。前者为阳离子交换剂，后者为阴离子交换剂。离子交换层析中，基质是由带有电荷的树脂或纤维素组成。带有负电荷的称之阳离子交换树脂；而带有正电荷的称之阴离子树脂。离子交换层析同样可以用于蛋白质的分离纯化。由于蛋白质也有等电点，当蛋白质处于不同的pH条件下，其带电状况也不同。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质，所以这类蛋白质被留在柱子上，然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施，将吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来。结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质，结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来。

♀ 疏水层析 疏水层析也称疏水作用下层析从分离纯化生命物质的机制来看，也属于吸附层析一类。疏水层析和反相层析分离生命物质的依据是一致的，利用固定相载体上偶联的疏水性配基与流动相中的一些疏水分子发生可逆性结合而进行分离。该方法基于的是蛋白质的疏水差异，在高盐溶液中，蛋白质会与疏水配基相结合，而其他的杂蛋白则没有此种性质，利用此种性质，可以将蛋白质初步的分离，用于盐析之后的蛋白质进一步提纯。

♀ 多模式层析 近年来有多家填料供应商开发出多模式填料，目前主流的多模式填料有阳离子+疏水以及阴离子+疏水。多模式层析结合了离子交换高分辨率的同时，结合了疏水层析高耐盐的特性，使得层析过程可以在高盐的条件进行上样，从而有更高的可操作空间，适合复杂样品的纯化。多模式层析填料的筛选应当注意目标产物的疏水性，对于疏水性较高的目标产物容易出现难以洗脱的情况（疏水性较高时，离子力以及疏水力的双重作用使得目标产物与填料结合较为牢固难以洗脱，而采用高盐洗脱时会导致填料的疏水性占主导从而导致收率较低的情况），因此对于疏水性较强的目标产物应当选用配基密度较低的填料，或者在层析过程中添加精氨酸来削弱疏水力进行工艺开发。对于疏水性适中的目标产物则可以通过一系列梯度实验进行填料筛选和工艺开发。           

2 抗体药物下游纯化常用的层析技术

A：如下

♀ 概述 针对生物制品的纯化，常用的层析技术主要有亲和层析和离子交换层析。

♀ 亲和层析 一般用作抗体捕获，中间纯化阶段，由于其收率高、去除杂质能力强，是抗体纯化中必不可少的一个步骤。常用的亲和层析填料是蛋白A，其原理和运用详见《抗体药物研发问答166~170 《Protein A亲和层析》》

♀ 离子交换层析 离子交换层析是一种依据目标产物与杂质电荷差异而分离的纯化方式，通常用在目标产物的精纯阶段。根据交换离子的不同可分为阴离子交换层析和阳离子交换层析。根据层析目的的不同，离子交换层析过程可选用两种模式：

流穿模式：目标产物与填料不结合，而尽量将杂质结合在层析填料上；

结合洗脱模式：目标产物与填料结合，再使用一定浓度的盐进行洗脱。

选用合适的层析填料以及层析模式，首先就要明确层析目的以及目标产物的等电点PI（电荷性质），目标产物的PI可以通过目标产物序列计算获得（理论等电点），也可以通过毛细管等电聚焦电泳（CIEF）来获得（实际等电点）。离子交换层析常用于精纯步骤，可以有效去除聚体、HCD、HCP、内毒等杂质。

3 层析术语基本知识

A：如下

♀ 概述 学习层析之前需要先了解层析相关的基本概念，本文汇总了层析术语如下：

01-层析相关体积

02-分辨率

03-选择性和有效性

04-柱效

05-线性流速和体积流速

06-固定相和流动相

07-载量

 01-层析相关体积

A：如下

♀ Vs 固相凝胶的体积 

♀ Vo 外水体积 

♀ Vi 填料颗粒内径体积 

♀ Vc 柱体积。柱体积=固相凝胶的体积+外水体积+填料颗粒内径体积

 02-分辨率

A：如下

♀ 分辨率 指相邻两个峰的分开程度，定义为相邻两峰保留值之差与两峰宽之和的一半的比值式中，用Rs来表示。当Rs为1时，两组分具有较好的分离，各个组分的纯度约为98%。

 03-选择性和有效性

A：如下

♀ 选择性 是分辨率优化的方向之一，指两个组分之间分离的宽度。与填料的选择、优化的条件有关。

♀ 有效性 是分辨率优化的方向之一，指一个组分的高度。与调料的颗粒直径、目标分子的大小、运行的速度有关。

 

04-柱效

A：如下

♀ 柱效 柱效是指理论塔板数N。N取决于固定相的种类、性质（粒度、粒径分布等）、填充状况、柱长、流动相的种类和流速及测定柱效所用物质的性质。

如果峰形对称并符合正态分布，N可近似表示为：理论塔板数=5.54(保留时间/半高峰宽)^2 。

柱效率用理论塔板数定量地表示：N=16*(t/w)^2。其中，t是溶质从进样到最大洗脱峰出现的时间，w为该溶质的洗脱峰在基线处的宽度。在一色谱柱中用相同的洗脱条件时候，不同化合物的滞留时间与其洗脱峰宽度之比接近常数。因此理论塔板数大的色谱柱效率高。当然，N的大小和柱子长度有密切关系：理论塔板高度H=柱长/N，用H可以衡量单位长度的色谱柱的效率，H越小，则色谱柱效率越高。N为常量时，W随tR成正比例变化。在一张多组分色谱图上，如果各组份含量相当，则后洗脱的峰比前面的峰要逐渐加宽，峰高则逐渐降低。用半峰宽计算理论塔板数比用峰宽计算更为方便和常用，因为半峰宽更容易准确测定，尤其是对稍有拖尾的峰。N与柱长成正比，柱越长，N越大。用N表示柱效时应注明柱长，如果未注明，则表示柱长为1米时的理论塔板数。（一般HPLC柱的N在1000以上。）若用调整保留时间（tR’）计算理论塔板数，所得值称为有效理论塔板数（N有效或Neff）=16(tR’/W)^2

 05-线性流速和体积流速

A：如下

♀ 线性流速 液体沿着层析柱管单位时间向下迁移的距离（cm/h）。

♀ 体积流速 指相邻两个峰的分开程度，定义为相邻两峰保留值之差与两峰宽之和的一半的比值式中，用Rs来表示。当Rs为1时，两组分具有较好的分离，各个组分的纯度约为98%。液体沿着层析柱管单位时间向下的迁移距离（cm/h）。液体沿着层析柱管单位时间向下迁移的体积（ml/h）

从线性速度到体积流速换算: 体积流速=线性流速/60×层析柱的横截面积;

从体积流速到线性流速换算: 线性流速=体积流速×60/层析柱的横截面积。

 06-固定相和流动相

A：如下

♀ 固定相 固定相是层析的一个基质。它可以是固体物质（如吸附剂，凝胶，离子交换剂等），也可以是液体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液），这些基质能与待分离的化合物进行可逆的吸附，溶解，交换等作用。它对层析的效果起着关键的作用。

♀ 流动相：在层析过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体或超临界体等，都称为流动相。柱层析中一般称为洗脱剂，薄层层析时称为展层剂。它也是层析分离中的重要影响因素之一。

 07-载量

A：如下

♀ 载量 单位体积填料吸附的样品量。

动态结合载量：DBC是指在真实实验条件下测得的可装载到固定相上且不会造成不必要损失的最大靶蛋白量。

静态结合载量：有效结合载量也叫静态结合载量，是指在一定的条件下，可以结合在层析填料上的真实样品的数量，它是使用真实的样品和介质充分浸润饱和，然后测定结合在填料上的样品总量。

载量是层析工艺中关键工艺参数之一。