1.常用的层析技术介绍2.抗体药物下游纯化常用的层析技术
3.层析术语基本知识
01-层析相关体积、02-分辨率、03-选择性和有效性、04-柱效、05-线性流速和体积流速、06-固定相和流动相、07-载量1
1.常用的层析技术介绍
A:如下
2 抗体药物下游纯化常用的层析技术
A:如下
3 层析术语基本知识
A:如下
01-层析相关体积
A:如下
♀ Vc 柱体积。柱体积=固相凝胶的体积+外水体积+填料颗粒内径体积
02-分辨率
A:如下
03-选择性和有效性
A:如下
♀ 选择性 是分辨率优化的方向之一,指两个组分之间分离的宽度。与填料的选择、优化的条件有关。
♀ 有效性 是分辨率优化的方向之一,指一个组分的高度。与调料的颗粒直径、目标分子的大小、运行的速度有关。
04-柱效
A:如下
♀ 柱效 柱效是指理论塔板数N。N取决于固定相的种类、性质(粒度、粒径分布等)、填充状况、柱长、流动相的种类和流速及测定柱效所用物质的性质。
如果峰形对称并符合正态分布,N可近似表示为:理论塔板数=5.54(保留时间/半高峰宽)^2 。
柱效率用理论塔板数定量地表示:N=16*(t/w)^2。其中,t是溶质从进样到最大洗脱峰出现的时间,w为该溶质的洗脱峰在基线处的宽度。在一色谱柱中用相同的洗脱条件时候,不同化合物的滞留时间与其洗脱峰宽度之比接近常数。因此理论塔板数大的色谱柱效率高。当然,N的大小和柱子长度有密切关系:理论塔板高度H=柱长/N,用H可以衡量单位长度的色谱柱的效率,H越小,则色谱柱效率越高。N为常量时,W随tR成正比例变化。在一张多组分色谱图上,如果各组份含量相当,则后洗脱的峰比前面的峰要逐渐加宽,峰高则逐渐降低。用半峰宽计算理论塔板数比用峰宽计算更为方便和常用,因为半峰宽更容易准确测定,尤其是对稍有拖尾的峰。N与柱长成正比,柱越长,N越大。用N表示柱效时应注明柱长,如果未注明,则表示柱长为1米时的理论塔板数。(一般HPLC柱的N在1000以上。)若用调整保留时间(tR’)计算理论塔板数,所得值称为有效理论塔板数(N有效或Neff)=16(tR’/W)^2
05-线性流速和体积流速
A:如下
♀ 线性流速 液体沿着层析柱管单位时间向下迁移的距离(cm/h)。
♀ 体积流速 指相邻两个峰的分开程度,定义为相邻两峰保留值之差与两峰宽之和的一半的比值式中,用Rs来表示。当Rs为1时,两组分具有较好的分离,各个组分的纯度约为98%。液体沿着层析柱管单位时间向下的迁移距离(cm/h)。液体沿着层析柱管单位时间向下迁移的体积(ml/h)
从线性速度到体积流速换算: 体积流速=线性流速/60×层析柱的横截面积;
从体积流速到线性流速换算: 线性流速=体积流速×60/层析柱的横截面积。
06-固定相和流动相
A:如下
♀ 固定相 固定相是层析的一个基质。它可以是固体物质(如吸附剂,凝胶,离子交换剂等),也可以是液体物质(如固定在硅胶或纤维素上的溶液),这些基质能与待分离的化合物进行可逆的吸附,溶解,交换等作用。它对层析的效果起着关键的作用。
♀ 流动相:在层析过程中,推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体或超临界体等,都称为流动相。柱层析中一般称为洗脱剂,薄层层析时称为展层剂。它也是层析分离中的重要影响因素之一。
07-载量
A:如下
♀ 载量 单位体积填料吸附的样品量。
动态结合载量:DBC是指在真实实验条件下测得的可装载到固定相上且不会造成不必要损失的最大靶蛋白量。
静态结合载量:有效结合载量也叫静态结合载量,是指在一定的条件下,可以结合在层析填料上的真实样品的数量,它是使用真实的样品和介质充分浸润饱和,然后测定结合在填料上的样品总量。
载量是层析工艺中关键工艺参数之一。
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