hello,大家好,又到了医学方“文献精读专题”。自从医学方推出这个专题以来得到了大家的广泛肯定及好评,应广大读者需求,我们积极筹备更新此专题,希望大家一如既往的支持,谢谢!好了~废话不多说,这次我们讲解一篇影响因子在9.11的文章,正式开始我们本次的庖丁解牛。
背景
所有真核细胞都利用自噬进行蛋白质和细胞器周转,从而确保亚细胞质量控制、稳态和存活。为了应对人类自噬相关基因鉴定的最新进展,并在全系统水平上描述自噬,我们通过合并各种原始数据集和检索各自的相互作用数据,建立了一个以自噬为中心的基因相互作用网络。分析所得网络(“AXAN”)相对于子网,例如主基因子网(包括核心机制、信号通路和自噬受体)和转录子网。
为了描述该网络中进化的各个方面,我们评估了99种真核模式生物中蛋白质直系同源物的存在。我们可视化了主要基因类别的进化趋势和选定AXAN基因的进化轨迹。该分析证实了自噬核心基因的真核起源,同时指出了自噬受体的多样化进化历史。
接下来,我们使用模块识别来描述通路模块级别的网络功能解剖结构。除了明显的途径(例如,溶酶体降解,胰岛素信号传导)之外,我们的数据还揭示了上下文相关模块的存在,例如Rho GTPase信号传导。最后,我们使用基于图像的三方RNAi筛选来测试预测在自噬调节中发挥作用的候选基因。我们验证了Rho GTPase,CDC42,作为自噬相关信号传导的新型调节因子。这项研究强调了全系统方法的适用性,以获得对复杂生物过程的新见解,并以前所未有的详细程度描述人类自噬途径。
图1. AXAN 及其子网概述。
(A)注释的扩展自噬网络(AXAN)概述,显示自噬核心(绿色),信号传导(蓝色),受体(黑色)和介质(灰色),以及其他基因(小灰色圆圈)。灰色边缘:蛋白质-蛋白质相互作用(浅:中等置信度;深:高置信度);红边:转录调控。单例基因和成对基因相互作用显示在底部。为简单起见,
(B)中仅显示初基因之间的边缘。
(C)AXAN的定量网络参数,AXAN的随机版本(兰特。AXAN)和3个类似规模的随机人际网络。
(D)自噬原基因的细胞类型特异性表达。条形图显示了与随机非自噬基因相比,给定细胞类型中表达的主要基因的过度代表性百分比。*, P < 0.05;**, P < 0.01;N.S.,不重要。
(E)主要基因相互作用网络。显示所有AXAN原基因及其相互作用。节点大小对应于度数(邻居数)。该网络上的度分布和布局算法(弹簧嵌入式布局,由边缘中介性加权)取消了子区域的存在:虚线,自噬核心和信号域之间的空间分离;红色区域,蛋白激酶A亚区;蓝色,BECN1-UVRAG亚区。
(F) AXAN 内的转录子网。显示AXAN中的转录因子(红色菱形)及其靶基因。如上所述,自噬初代基因(大圆圈)通过颜色编码进行标记。AXAN 中的非主要靶基因显示为小圆圈。
图2. AXAN 主要基因的进化趋势.
使用InParanoid99数据库,通过对7个真核模式生物(和大肠杆菌作为外组)的直系同源物鉴定来评估AXAN内功能类别中人类基因的进化保守性。进化趋势显示为各自系统发育组中保守人类基因的百分比。两千个随机选择的人类基因作为对照(红色虚线)。
(B)所有9个人类自噬受体,2个核心基因,2个信号基因和2个非AXAN控制基因(管家酶ALDH9A1和T细胞受体基因CD3E,用星号标记)的进化保守。灰色条,该组内一个物种的直系同源物;黑条,该组中至少2个物种的直系同源物。
(C 和 D)2个示例性AXAN基因(核心基因ATG4B和受体STBD1)的进化轨迹。圆圈代表物种,方框表示包含这些物种的高阶分类群。给定物种中直系同源物的存在由黑色符号可视化。对于较高的组,着色显示该组中一个(灰色)或至少两个(黑色)物种中存在直系同源物。例如,显示了高度保守的自噬核心基因ATG2B和自噬受体基因STBD4(最近的自噬受体)。
图3. AXAN 的功能架构。
(A)使用AXAN基因构建基于途径的功能相互作用网络(使用Reactome数据库),然后进行GLay群落聚类以鉴定模块。21个单独的模块以不同的颜色显示。
(B)将模块转换为节点大小与节点数相对应的小节点。着色说明了自噬核心(绿色)和/或信号传导(蓝色)基因的比例。根据途径富集分析添加先导项。亚节点之间的边缘对应于潜在基因之间的相互作用。模块 M05 和 M06 以粗体突出显示。
(C)“自噬”模块(M05)。
(D)“胰岛素和MTOR信号”模块(M06)。在这两个模块中,主要基因根据其类别(绿色,核心;蓝色,信号传导)显示。红色虚线强调存在与特定生物学功能相关的较小功能子模块(见正文)。
图4. 网络预测的功能评估。
(A)引入外部接头节点(菱形)以将迄今为止孤立的节点(白色圆圈)连接到AXAN主网络(如上所述的初代基因的颜色编码)。仅显示那些选择用于功能性siRNA筛选的接头节点及其一级邻居。黄色,候选接头基因未通过所有测试标准;红色,从功能筛选中击中基因。
(B)基于图像的siRNA筛查结果摘要,旨在评估接头节点在自噬途径中的作用。使用了三种独立的测定:将胞质RFP-EGFP融合蛋白递送到溶酶体(lysoRG)作为自噬的量度,定量内源性Lys63 / K63连接的泛素(UB-K63)水平以及在噬菌条件下定量过氧化物酶体质量(使用CAT/过氧化氢酶作为内源性标志物)(CT,作为噬菌的量度)。效果强度使用 si-negCTRL 归一化值显示。紫色,基因敲低降低自噬效应;绿色,击倒增加效果。在测试的 17 个候选基因中,5 个通过了 2 个测试中的 3 个,具有相同方向的效果(橙色),4 个通过了同一方向的所有 3 个测试(红色)。选择CDC42(用星号标记)进行进一步分析,基于效应强度,其在cSAN中的程度以及其直接邻居(NB)中的主要基因数量。
(C)Rho GTPase,CDC42的敲低如何影响3个基于图像的读数的示例(比例尺:10μm)。
图5. CDC42对自噬途径的影响。
(A)敲低CDC42(或ATG5作为阳性对照)损害ptfLC3转染的Huh7细胞中仅红色结构的形成(EBSS中饥饿4小时)。这些结构与溶酶体标记物LAMP1(蓝色)的共定位仅出现在转染了阴性对照siRNA(si-neg)的细胞中。溶酶体抑制剂巴非霉素A治疗1(Baf,20 nM)作为阳性对照。比例尺:5 μm。
(B)通过蛋白质印迹分析ATG5和CDC42的敲低。ACTB/β-肌动蛋白作为负荷对照。
图6. CDC42在自噬相关途径上的功能作用。
(A)互补AXAN(cAXAN)内CDC42的一级邻居子网。CDC42(红色菱形)、主要基因(蓝色,信号;黑色、受体)和以前的单例基因 DOCK8(白色)用大符号显示,其他 AXAN 基因用小符号显示,
(B)敲低ATG7(对照)和CDC42对自噬激活剂雷帕霉素(Rapa)诱导的信号通路的影响。ACTB/β-肌动蛋白作为负荷对照。
(C)敲低CDC42对Huh3细胞中雷帕霉素(Rapa)诱导的LC7丰度和脂化的影响。
总之,我们的方法从迄今为止前所未有的系统角度描述了自噬途径,并说明了网络生物学在简化研究工作方面的适用性。它还持有一个前提并支持这样一种观点,即计算方法,特别是那些实现网络和系统生物学的方法,将成为未来解释多平台和多中心大规模功能研究不可或缺的资产。
好了,今天的文献就先读到这里, 我们下期再见!
联系客服