研究背景
外泌体可以将治疗性RNA传递给神经元。外泌体的组成和安全性取决于产生外泌体的细胞的类型。间充质干细胞被认为是治疗性外泌体生产的一种有吸引力的细胞类型。然而，缺乏从间充质干细胞中分离和制造外泌体的可扩展方法，这限制了外泌体技术的临床转化。
研究评估了来自不同来源的间充质干细胞，发现脐带来源的间充质干细胞产生最高的外泌体产量。为了优化外泌体的产生，我们在可扩展的基于微载体的三维（3D）培养物中培养脐带衍生的间充质干细胞。
结合传统的差异超速离心，3D 培养产生的外泌体（20D-UC 外泌体）比二维培养（3D-UC 外泌体）多 2 倍。切向流过滤 （TFF） 与 3D 间充质干细胞培养相结合，进一步将外泌体（3D-TFF-外泌体）的产量提高 7D-UC 外泌体的 3 倍。
与3D-UC外泌体相比，2D-TFF外泌体在向神经元的小干扰RNA（siRNA）转移方面的效力是3D-UC外泌体的七倍。基于微载体的 <>D 培养和 TFF 允许从间充质干细胞中可扩展地生产生物活性外泌体。这些发现解除了间充质干细胞外泌体临床应用的主要障碍。
研究内容
见图一
脐带间充质干细胞产生最多的外泌体
图一
（A）通过差异超速离心从源自脐带（U-MSC），骨髓（BM-MSC）或脂肪（A-MSC）的间充质干细胞中分离的外泌体的产量。产量计算为通过纳米颗粒跟踪分析测量的分离样品中的外泌体数量除以源培养物中的细胞数量。显示了七个实验的结果，平均±SD，单因子方差分析。
（B）在（A）中纯化的U-MSC，BM-MSC或A-MSC外泌体的平均大小。
见图二
间充质干细胞培养方法及外泌体分离方法方案
图二
（A）基于烧瓶的（二维）间充质干细胞培养示意图。将细胞在间充质基础培养基中的三层烧瓶中培养至密度为20，000个细胞/cm2.（B）基于微载体的（三维）间充质干细胞培养示意图。将细胞在微载体上培养在无血清/GMP 兼容培养基中的 250 mL 旋转瓶中培养至 ∼40，000 个细胞/cm2.
（C）通过差速超速离心分离外泌体。外泌体通过顺序超速离心从培养物上清液中富集，如图所示进行过滤和洗涤步骤。
（D）通过切向流过滤分离外泌体。如图所示，通过使用500 kDa截止滤芯的切向流过滤，从培养物上清液中富集外泌体。
见图三
外泌体的表征
图三
（A）通过2D-UC，2D-TFF，3D-UC或3D-TFF分离的外泌体的产量（n = 12次测量）。产量计算为通过纳米颗粒跟踪分析测量的分离样品中的外泌体数量除以源培养物中的细胞数量。图显示每个实验的产量，以及所有测量值的平均± SD，单因子方差分析与Tukey的多重比较检验。
（B）外泌体（CD81、CD9和CD63）中存在的蛋白质的蛋白质印迹分析。钙连接蛋白是一种阴性对照，存在于细胞中，但不存在于外泌体中。
（C）通过LC-MS / MS蛋白质组学在外泌体变体和细胞中检测到的蛋白质水平。蛋白质含量通过基于强度的绝对定量（iBAQ）分析测定。
（D）通过差示超速离心（UC）或切向流过滤（TFF）从二维（2D）或三维（3D）培养物中分离的外泌体的大小分布。通过纳米颗粒跟踪分析测量外泌体的浓度和大小。
（E） 绘制了 2D-UC- （n = 23）、2D-TFF- （n = 12）、3D-UC-（n = 18） 和 3D-TFF-外泌体 （n = 14） 的平均大小，显示了所有测量的平均± SD，单因素方差分析与 Tukey 的多重比较检验。
（F）通过UC或TFF从2D或3D培养物中分离的外泌体制剂中每微克蛋白质的颗粒数。通过纳米颗粒跟踪分析测量的颗粒数量，以及通过布拉德福德蛋白质测定测量的蛋白质浓度。图显示每个测量的结果，以及所有测量的平均±SD，单因素方差分析与Tukey的多重比较检验。
见图四
外泌体的蛋白质组学含量。
图四
（A）在2D-UC外泌体（浅灰色），2D-TFF外泌体（深灰色），3D-UC外泌体（浅蓝色）和3D-TFF外泌体（深蓝色）中检测到的蛋白质的维恩图。数字表示每组中检测到的蛋白质数量。百分比分别表示仅 2D-UC、仅 2D-TFF、仅 3D-UC 和仅 3D-TFF 的独特蛋白质在 2D-UC、2D-TFF、3D-UC 和 3D-TFF 的总蛋白质量中所占的比例。蛋白质量通过基于强度的绝对定量（iBAQ）分析确定。
（B）二维培养（2D-UC和2D-TFF），三维培养（3D-UC和3D-TFF），差示超速离心（2D-UC和3D-UC）和切向流过滤（2D-TFF和3D-TFF）特异性蛋白质水平，来自（A），单向方差分析。蛋白质水平通过基于强度的绝对定量（iBAQ）分析确定。
（C）二维培养（2D-UC和2D-TFF），三维培养（3D-UC和3D-TFF），差示超速离心（2D-UC和3D-UC）和切向流过滤（2D-TFF和3D-TFF）特异性蛋白质的大小分布，来自（A），单向方差分析。（D）所有外泌体变体（薰衣草），仅2D外泌体（黑色），仅3D外泌体（深蓝色），仅UC外泌体（浅蓝色）和仅TFF外泌体（灰色）共享或独特的蛋白质的基因本体分析，来自（A）。
见图五
TFF-外泌体在向神经元递送siRNA方面更有效
图五
（A）剂量反应分析显示用含有指定剂量siRNA的2D-UC-，2D-TFF-，3D-UC-和3D-TFF外泌体处理的小鼠原代神经元中的亨廷顿（Htt）mRNA水平。每个数据点代表n = 3个实验的平均值±SEM，双向方差分析。
（B）用含有Cy2标记siRNA的2D-UC-，3D-TFF-，3D-UC-和3D-TFF-外泌体处理的原代神经元的荧光时间过程。每个数据点表示每个时间点 62-143 个细胞的平均± SEM，双向方差分析。UNT，未经治疗。
研究结论
为了开发一种适合生产的可扩展外泌体生产方法，我们比较了来自常见来源的间充质干细胞的外泌体产量和倍增时间：骨髓、脂肪组织和脐带沃顿氏果冻（即脐带结缔组织）。
脐带间充质干细胞不同于脐带血造血干细胞。在传统的基于塑料瓶的培养中，脐带间充质干细胞的生长速度（约4天倍增时间）比来自骨髓或脂肪组织的间充质干细胞（约7天倍增时间）更快。
脐带间充质干细胞每个细胞产生的外泌体是来自骨髓（p = 0.0063）或脂肪组织（p = 0.006）的间充质干细胞的四倍（图1A）。来自脐带间充质干细胞的外泌体也比来自骨髓（140±18nm;p = 116.9）和脂肪组织（0±01nm;p = 105.12）间充质干细胞的外泌体大（0±0004nm）（图1B）。
基于它们的可用性、有利的倍增时间和每个细胞高产量的外泌体，我们使用脐带间充质干细胞开发了一种可扩展的外泌体分离方法。
好了 今天的文献解读就到这儿来，我们下期再见！
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