本期小编为大家解析一篇发表在 JOURNAL OF CLINICAL INVESTIGATION 期刊上发表的文章，题目是Macrophage miR-149-5p induction is a key driver and therapeutic target for BRONJ（巨噬细胞miR-149-5p诱导是BRONJ的关键驱动因素和治疗靶点）下面我们跟随文献解读进行进一步学习。
研究背景
// 2023 summer
”
双膦酸盐相关（BP相关）颌骨坏死（BRONJ）是给予血压的严重副作用之一，例如唑来膦酸（ZA），可破坏患者的生活质量。尽管已经观察到血压对骨骼血管系统和骨吸收活性的直接靶标，但 BRONJ 的潜在机制在很大程度上仍然难以捉摸。
因此，迫切需要发现基于BRONJ发展的多方面潜在机制的有效治疗靶点。在这里，我们确定了ZA处理的巨噬细胞在拔牙窝（TES）愈合过程中对破骨细胞分化和H型血管形成的抑制作用。
在机制上，ZA激活了NF-κB信号通路，然后诱导巨噬细胞中的p65核易位以促进miR-149-5p转录，通过直接结合Traf6 3′-UTR区域导致破骨细胞分化受损。
此外，我们发现源自ZA处理的骨髓来源巨噬细胞的miR-149-5p负载细胞外囊泡可以通过Rap1a / Rap1b / VEGFR2途径调节内皮细胞的生物学功能。此外，局部施用化学修饰的拮抗剂R-149-5p被证明对BRONJ小鼠具有治疗效果。
研究内容
见图一
BRONJ小鼠模型显示破骨细胞活性降低和骨骼血管生成受损。
图一
（A）建立BRONJ小鼠模型的时间表。数字表示治疗天数。
（B）TES牙龈粘膜的临床表现。红色虚线勾勒出与第二磨牙（SM）相邻的开放窝。量化具有开放插座的小鼠数量。
（C）TES中新骨填充的显微CT分析。
（D）苔丝新骨BV/TV和BMD的定量测量。
（E）拔牙4周后TES的代表性H&E染色图像。比例尺：100 μm。n = 6。
（F）具有代表性的TRAP染色图像，显示TES中破骨细胞活性和破骨细胞数量的量化。比例尺：100 μm。n = 6。
（G） 具有代表性的 EMCN 免疫染色图像你好CD31你好来自对照和 BRONJ 小鼠的 TES 中的血管。比例尺：100 μm。n = 6。
（H）血管周围骨祖细胞的代表性免疫染色图像。比例尺：100 μm。n = 6。
（I和J）F4 / 80CD86（M1）或F4 / 80CD206（M2）巨噬细胞的代表性免疫染色图像。比例尺：100 μm。n = 6。结果表示为标准偏差±平均值*P < 0.05;**P < 0.01 通过学生的 t 检验。
见图二
ZA 处理的 BMM 会阻碍 EC 的生物学功能。
图二
（A） 代表性免疫染色图像，显示骨髓来源巨噬细胞 （BMM） 和用 5-FAM-ZA （10 μM） 处理的 EC，用于指定的时间和定量分析。比例尺：20 μm。n = 3。
（B） CCK8 测定分析显示用 ZA 直接处理、用 BMM 共培养或用 ZA 处理的 BMM 共培养后 EC 增殖。n = 3。
（C）ECs伤口划痕测定和定量分析的代表性图像。比例尺：100 μm。n = 3。
（D）EC的Transwell迁移测定和定量分析的代表性图像。比例尺：100 μm。n =3.
（E）EC CD31和VEGF表达的蛋白质印迹和半定量分析。n = 3。
（F）ECs的管形成测定和定量分析的代表性图像。比例尺：100 μm。n = 3。结果以标准偏差±平均值表示。*P < 0.05;**P < 0.01;< 0.001;P > 0.05 by 1-way 方差分析。
见图三
源自ZA处理的BMM的细胞外囊泡抑制EC的生物学功能。
图三
（A）通过透射电子显微镜获得来自骨髓来源的巨噬细胞（BMM）的细胞外囊泡（EV）的代表性图像。比例尺：100μm。
（B）电动汽车的纳米颗粒跟踪分析，用于计算尺寸分布。y 轴表示颗粒数浓度，x 轴表示颗粒大小。
（C）通过蛋白质印迹检测EV和BMM中的CD63，HSP70和calnexin。
（D）代表性的免疫染色图像，显示来自BMM的DiI标记的EV进入在指定时间内共培养的ECs。比例尺：20 μm。n = 3。
（E） CCK8 测定分析显示与 BMM 衍生的 EV 共培养后 EC 增殖。n = 3。
（F）ECs伤口划痕测定和定量分析的代表性图像。比例尺：100 μm。n = 3。
（G）EC的Transwell迁移测定和定量分析的代表性图像。比例尺：100 μm。n =3.
（H） CD31 和 EC 的 VEGF 表达的蛋白质印迹和半定量分析。n = 3。
（I）ECs管形成测定和定量分析的代表性图像。CEV，控制BMM衍生的电动汽车;ZEV，ZA处理，源自BMM的电动汽车。比例尺：100 μm。n = 3。结果表示为SD *P < 0.05±平均值;**P < 0.01;P < 0.001;P > 0.05 x 1 路方差分析。
见图四
ZA 激活 p65 核易位以促进 BMM 衍生电动汽车中的 miR-149-5p 转录和加载。
图四
（A） 骨髓来源的巨噬细胞衍生（BMM 衍生）EV 中 miRNA 差异表达的无监督分层聚类和热图。
（B）显示差异miRNA的火山图。
（C）来自BMM衍生的电动汽车中miR-149-5p相对表达的qRT-PCR分析。n = 5。
（D）miR-149-5p靶基因在生物过程中的基因本体（GO）富集气泡图。
（E）ZA或JSH-65处理后核提取物中p23的蛋白质印迹分析。
（F）ZA或JSH-65处理后细胞质提取物中p65磷酸化（P-P23）和ikb-α的蛋白质印迹分析。
（G） E和F蛋白质印迹的半定量分析。n = 3。
（H）在BMM中pri-miR149相对表达的qRT-PCR分析。n = 6。
（I）通过FISH测定标记的BMM中miR-149-5p的分布。比例尺：20 μm。
（J） p65 与 pri-miR149 启动子推定区域结合的 ChIP 分析。n = 5。
（K）构建WT和突变载体用于双荧光素酶报告基因测定，以确认p65与pri-miR149启动子推定区域结合的结果。n = 5。结果表示为标准偏差±平均值*P < 0.05;**P < 0.01;< 0.001;P > 0.05 通过学生 t 测试或单因素方差分析。
见图五
miR-149-5p直接靶向Rap1a/Rap1b并调节VEGFR2途径。
图五
（A） CCK8 测定分析显示用 miR-149-5p 模拟物或抑制剂转染后 EC 增殖。n = 3。
（B）ECs伤口划痕测定和定量分析的代表性图像。比例尺：100 μm。n = 3。
（C）EC的CD31和VEGF表达的蛋白质印迹和半定量分析。n = 3。
（D）EC的管形成测定和定量分析的代表性图像。比例尺：100 μm。n = 3。
（E）通过生物信息学分析和双荧光素酶报告基因测定鉴定Rap149a的5′-UTR上的miR-3-1p结合位点。n = 5。
（F）通过生物信息学分析和双荧光素酶报告基因测定鉴定Rap149b的5′-UTR上的miR-3-1p结合位点。n = 5。
（G）与Rap1a/Rap1b/VEGFR2途径相关的蛋白质的蛋白质印迹分析。
（H） G中蛋白质印迹的半定量分析。n = 3。
（I）用miR-1-1p模拟物或抑制剂转染EC后Rap149a和Rap5b表达的代表性免疫染色图像和定量分析。比例尺：100 μm。n = 3。结果以标准偏差±平均值表示。*P < 0.05;**P < 0.01;< 0.001;P > 0.05 通过学生的 t 检验。
图六
miR-149-5p直接与Traf3的6′-UTR结合并阻碍破骨细胞分化。
图六
（A） TRAP 染色显示用 PBS 或 ZA 处理后破骨细胞形成。比例尺：100 μm。n = 3。
（B）用PBS或ZA处理后显示骨吸收坑（红色箭头）的小麦胚芽凝集素染色。比例尺：100 μm。n = 3。
（C）NFATc1和CTSK表达的蛋白质印迹和半定量分析。n = 3。
（D）用miR-149-5p模拟物或抑制剂转染后破骨细胞的TRAP染色和骨吸收坑（红色箭头）测定。比例尺：100 μm。n = 3。
（E）NFATc1，CTSK和TRAF6表达的蛋白质印迹和半定量分析。n = 3。
（F）WT和突变Traf6载体进行双荧光素酶报告基因测定。n = 5。
（G） TRAP 染色显示用 ZA+NC 抑制剂（ZA 和 miR-149-5p 阴性对照）或 ZA+ 抑制剂（ZA 和 miR-149-5p 抑制剂）处理后破骨细胞形成。比例尺：100 μm。n = 3。
（H）用ZA + NC抑制剂或ZA +抑制剂处理后显示骨吸收坑（红色箭头）的小麦胚芽凝集素染色。比例尺：100 μm。n = 3。
（I）NFATc1和CTSK表达的蛋白质印迹和半定量分析。n = 3。结果表示为标准偏差±平均值*P < 0.05;**P < 0.01;P > 0.05 通过学生的 t 测试。
见图七
拮抗剂R-149-5p的局部递送可预防小鼠的BRONJ。
图七
（A）将PBS（空载体对照），拮抗剂R-NC和拮抗肌R-149-5p本地递送到BRONJ模型小鼠中的时间表。数字表示治疗天数。
（B）TES牙龈粘膜的临床表现。红色虚线勾勒出与第二磨牙相邻的暴露骨窝。量化具有开放插座的小鼠数量。
（C）TES中新骨填充的显微CT分析。
（D）苔丝新骨BV/TV和BMD的定量测量。n = 6。
（E）拔牙4周后TES的代表性H&E染色图像。比例尺：100 μm。n = 6。
（F）具有代表性的TRAP染色，显示TES中破骨细胞活性和破骨细胞数量的定量。比例尺：100 μm。n = 6。
（G） 具有代表性的 EMCN 免疫染色图像你好CD31你好来自拮抗剂R-NC和拮抗剂R-149-5p小鼠的TES中的血管。比例尺：100 μm。n = 6。
（H）血管周围骨祖细胞的代表性免疫染色图像。比例尺：100 μm。n = 6。结果以标准偏差±平均值表示。*P < 0.05;**P < 0.01;P > 0.05 乘 1 路方差分析。
见图八
巨噬细胞miR-149-5p调控BRONJ骨骼血管生成和骨重塑的工作模型。
图八
ZA 激活了 NF-κB 信号通路，诱导骨髓来源巨噬细胞 （BMM） 中的 p65 核易位以促进 miR-149-5p 转录，从而通过直接结合 Traf6 3′-UTR 区域抑制破骨细胞分化。此外，源自ZA处理的BMM的miR-149-5p负载EV可以通过BRONJ的Rap1a / Rap1b / VEGFR2途径调节骨骼血管生成。
研究结论
总之，我们的研究结果阐明了miR-149-5p对骨骼血管生成和骨重塑的双重影响，表明它是BRONJ的有希望的预防和治疗靶点。
好了，今天的文献解读就到这儿来，我们下期再见！
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