本期小编为大家解析一篇今年出炉的发表在 nature 期刊上的文章，题目是RBFOX2 modulates a metastatic signature of alternative splicing in pancreatic cancer《 RBFOX2调节癌症选择性剪接的转移特征 》下面我们跟随文献解读进行下一步学习。
研究背景
// 2023 summer
”
胰腺导管腺癌（PDA）的特征是侵袭性局部浸润和转移扩散，导致高致死率。尽管PDA进展过程中的驱动基因突变是保守的，但没有特异性突变与转移瘤的播散相关1，2，3 .在这里，我们分析了大量原发性和转移性PDA肿瘤的RNA剪接数据，以确定与PDA进展相关的差异剪接事件。
对这些事件的从头基序分析检测到与RBFOX2基序高度相似的基序富集。RBFOX2在患者来源的异种移植（PDX）转移性PDA细胞系中的过表达大大降低了这些细胞在体外和体内的转移潜力，而原发性胰腺肿瘤细胞系中RBFOX2的耗竭增加了这些细胞的转移潜力。
这些发现支持RBFOX2作为PDA中有效的转移抑制因子的作用。RBFOX2靶基因的RNA测序和剪接分析揭示了RHO GTP酶途径中基因的富集，表明RBFOX2剪接活性在细胞骨架组织和粘附形成中的作用。
研究内容
见图一
PDA的另类拼接景观。
图一
a，通过PSI评分计算的胰腺癌患者395个样本中替代剪接事件的PCA。蓝点代表原发肿瘤样本，红点代表转移性肿瘤样本。插图显示了对临床注释（原发性或转移性）与其各自簇匹配的样本子集的 PCA 分析。
b，基于前249个差异剪接事件（PSI）对20个PDA患者样本进行无监督聚类。星号表示同一基因的不同剪接事件。还显示了突变状态、临床分期和总生存期 （OS）。最大值，最大值;最小值，最小值;突变，突变;WT，野生型;不适用，不可用。
c，原发性肿瘤和转移性肿瘤之间显着差异剪接基因的反应组途径分析。进入分析的基因具有强加的临界值（|ΔPSI| > 10%）和名义P值（P <0.05，过度代表性分析（超几何分布）测试）。基因集限制在5到500个基因之间，通路被过滤为P<0.05的统计阈值。
d，在参与RHO GTP酶途径的差异剪接基因中鉴定出的前两个富集基序19，40.e，RBFOX2在代表性原发性和PDX转移性胰腺肿瘤中的免疫印迹分析。微管蛋白和总 MEK1 （t-MEK1） 作为上样对照（每组 n = 4 个患者样本）。凝胶源数据在补充图中提供。
1. f，原发性和转移性肿瘤中RBFOX2蛋白相对于微管蛋白的定量（每组n = 4个患者样本;数据为平均值±SD）。
g，定量PCR逆转录（RT-qPCR）分析PDA患者原发性肿瘤和转移灶中RBFOX2表达（每组n = 15个患者样本;数据是平均值±s.d.）。
f，g，双尾学生 t 检验。NS，不重要。PDA患者的遗传改变和临床资料见补充表1;PDA患者样本中的差异剪接事件如补充表2所示;序列基序富集分析见补充表3;反应组分析见补充表4。
见图二
RBFOX2在胰腺癌进展中充当转移性肿瘤抑制因子。
图二
a， 用 pWZL（−）（空载体对照）或 RBFOX50 cDNA（RBFOX2 过表达 （OE））（左）转导的 X2 细胞的免疫印迹分析，用 CRISPR 对照转导的 BxPC3 细胞 （ctrl）、RBFOX2 sgRNA-1 或 RBFOX2 sgRNA-2（左二）、靶向 RBFOX2 外显子-内含子连接 （EIJ） 的 CRISPR 对照或 RBFOX2 特异性 sgRNA（左三），这些细胞再次用 pWZL（−） 或 RBFOX2 cDNA 转导（右）。
b，c，伤口愈合测定（b）和软琼脂测定（c）中X50细胞的菌落形成，左。
d，左，静脉注射表达pWZL（–）或RBFOX50 OE的mCherry标记的X2细胞（每组n = 10只小鼠）的NOD-SCID小鼠肺转移的定量。右图，通过明场（BF）（顶部）和荧光（底部）显微镜可视化的肺部代表性图像。比例尺，1，000 μm。
e，f，伤口愈合测定 （e） 和软琼脂测定 （f） 中描述的细胞集落形成，左起第二。
g，左，静脉注射表达CRISPR对照的GFP标记的BxPC3细胞，RBFOX2 sgRNA-1或RBFOX2 sgRNA-2（每组n = 9只小鼠）的NOD-SCID小鼠肺转移的定量。右图，通过明场（顶部）和荧光（底部）显微镜可视化的肺部代表性图像。比例尺，1，000 μm。
h，i，伤口愈合测定 （h） 和软琼脂测定 （i） 中描述的细胞的集落形成，左起第三和右 a。
j，表达用SFFV3（−）（空载体对照）或RBFOX2（ΔRRM）（左）转导的RBFOX2 EIJ sgRNA的BxPC2细胞和用编码SFFV50（−）或RBFOX2（ΔRRM）（右）的慢病毒转导的X2细胞的免疫印迹分析。
k，l，伤口愈合测定（k）和软琼脂测定（l）中细胞的集落形成，左。m，n，伤口愈合测定（m）和软琼脂测定（n）中细胞的集落形成，右。
a，j中的凝胶源数据在补充图中提供。2. 数据是平均值±标准差。在所有面板中，n≥3个独立实验中，显示了精确的P值。双向方差分析（b，e，f，h，i，k，m）或未配对的双尾学生t检验（c，d，g，l，n）。
见图三
RBFOX2调节胰腺癌进展中的剪接事件。
图三
a，维恩图显示了差分拼接事件的重叠，具有互易拼接。显示了两种比较：具有RBFOX50 OE的X2细胞与表达RBFOX3 sgRNA-2的BxPC1细胞，以及具有RBFOX50 OE的X2细胞与表达RBFOX3 sgRNA-2的BxPC2细胞。
b、a中描述的倒数拼接事件的ΔPSI。甜甜圈图显示了交替剪接事件类型的分布：单外显子跳跃（SES），替代5′剪接位点（alt 5′ss），替代3′剪接位点（alt 3′ss），互斥外显子（MXE），多外显子跳跃（MES）和内含子保留（IR）。P值使用PSI-sigma生物信息学分析计算（标称P值<0.05和|ΔPSI| > 10%）（详见方法）。
c，对a中确定的114个共享事件的Reactome途径分析。如方法中所述，分析中包含的基因施加了临界值。使用过度表征分析（超几何分布）检验过滤通路的统计阈值P<0.05。
d，用MBQ3（2.1μM）或DMSO处理的BxPC167 RBFOX0 sgRNA-05细胞的伤口愈合测定。
e，d中细胞的增殖测定。f，台盼蓝细胞计数描述在处理后24小时d。
g，左，静脉注射用载体或MBQ3（每公斤2mg）处理的GFP标记的BxPC1 RBFOX167 sgRNA-3细胞的NOD-SCID小鼠肺部的平均GFP强度（每组n = 7只小鼠）。右图，通过明场（顶部）和荧光（中）显微镜以及苏木精和伊红（H&E）染色（下图）可视化的肺部代表性图像。比例尺，1，000 μm。完整数据见补充图。12. h，实验期间小鼠的重量g。数据是平均值±标准差。在所有面板中，n ≥ 3 个独立实验。显示确切的 P 值。未配对双尾学生 t 检验 （f）、双向方差分析 （d，e、h） 或未配对单尾学生 t 检验 （g）。补充表4提供了反应组分析，补充表2列出了RBFOX6操纵细胞系中的差异剪接事件。
见图四
MPRIP剪接的调节调节胰腺肿瘤细胞的转移潜力。
图四
a，RBFOX2介导的MPRIP拼接方案。
b，逆转录PCR（RT-PCR）和定量表达CRISPR对照的BxPC3细胞，RBFOX2 sgRNA-1或RBFOX2 sgRNA-2以及表达pWZL（−）或RBFOX50 OE的X2细胞中的MPRIP PSI值。
c，胰腺癌患者样本中MPRIP PSI值的小提琴图（n = 22个原发性肿瘤和n = 20个转移瘤），使用LabChip GX分析。
d，来自PanCurX数据集的总生存期和MPRIP PSI值的Kaplan-Meier曲线。
e，底部，显示MPRIP拼接（跳跃）调制的方案。上图，用MPRIP sgRNA转导的BxPC3细胞中MPRIP剪接的RT-PCR分析。
f，g，伤口愈合测定（f）和e中细胞的软琼脂测定（g）中的集落形成。
h，左，静脉注射表达MPRIP sgRNA的GFP标记的BxPC3细胞的NOD-SCID小鼠肺部的平均GFP强度（每组n = 8只小鼠用于CRISPR对照和3'剪接位点MPRIP sgRNA，n = 5只小鼠对于5'剪接位点MPRIP sgRNA）。中心，通过明场（左）和荧光（中）显微镜可视化的肺部代表性图像，以及苏木精和伊红染色（右）（比例尺，1，000 μm）。右，来自重复体内实验的每组两个肺的RNA的RT-PCR分析（n = 4只小鼠用于CRISPR对照，n = 5只小鼠用于5'剪接位点MPRIP sgRNA）。
i，底部，MPRIP拼接（包含）方案（底部）。顶部，RT-PCR显示用DS-50 MPRIP sgRNA转导的X24细胞中的MPRIP剪接。
j，k，伤口愈合测定（j）和i中细胞的软琼脂测定（k）中的集落形成。
l，左，静脉注射表达CRISPR对照或DS-50 MPRIP sgRNA的GFP标记的X24转移细胞（每组n = 10只小鼠）的NOD-SCID小鼠肺部的平均GFP强度。中心，肺部的代表性图像。比例尺，1，000 μm。右图，RT-PCR分析来自每组两个肺的RNA。凝胶源数据，肺部图像和H&E染色在补充图中提供。
3、13和14。数据是平均值±标准差。在所有面板中，n ≥ 3 个独立实验。显示确切的 P 值。未配对双尾学生t检验（b，c，h，k，l），对数秩（Mantel-Cox）检验（d）和双向方差分析（f，g，j）。a，e，i 中的方案是用 Biorender.com 创建的。
研究结论
调节RBFOX2调节的剪接事件，例如通过肌球蛋白磷酸酶RHO相互作用蛋白（MPRIP），与PDA转移，细胞骨架组织改变和诱导局灶粘附形成有关。我们的研究结果暗示了RBFOX2作为PDA肿瘤抑制因子的剪接调节功能，并提出了转移性PDA的治疗方法。
好了·今天的文献解读就到这儿来，我们下期再见！
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