大家好，今天给大家解读一篇中国科学院杨运煌团队在《Nature Commu nications》发表的题为“Microfl uidic space coding for multip lexed nucleic acid detection via CRISPR-Cas12a and recom binase polyme rase ampli fication”的研究工作。该研究提出了一种将微流控装置与CRISPR - Cas12a和多重重组酶聚合酶扩增相耦合的核酸检测平台，命名为MiCaR。MiCaR可以同时检测多达30个核酸靶标，检测限达到0.26 attomole，多重检测仅需40 min。该平台被期望能够广泛地应用于多重核酸检测。
01
研究背景
快速、廉价和多重检测多种核酸对人类健康非常重要，但它仍然是一个重大挑战。在此，我们提出了一个名为MiCaR的核酸检测平台，该平台将microfluidic装置与CRISPR-C as12a和多重r组合酶聚合酶扩增偶联。
只需一个荧光探针，MiCaR就可以通过微流体空间编码同时测试多达30个核酸靶标。检测限达到 0.26 阿托摩尔，多重检测仅需 40 分钟。我们通过有效检测9价HPV疫苗靶向的九种HPV亚型来证明MiCaR的效用，在测试97个有HPV感染风险的患者样本时，灵敏度为8.98%，特异性为1.100%。
此外，我们还通过成功测试八种最临床相关的呼吸道病毒来展示我们方法的可推广性。我们预计这种有效、未经修饰且用途广泛的平台将广泛用于多重核酸检测。
见图一
基于MiCaR的HPV亚型策略方案。
图一
a 简要概述子类型过程中涉及的步骤。首先对收集的宫颈细胞标本进行热解。然后，进行RPA以扩增九种HPV亚型。随后通过微流体装置上的CRISPR-Cas12a系统对扩增子进行测试，然后进行荧光成像以获得读数。
b 片上测试原则。使用一个 30 重星爆形芯片 （SS-Chip），其中一个中央入口连接到 30 个插座。出口预装了识别相关靶标HPV亚型的各种Cas12a / crRNA。片上测定后，特定出口处的荧光读数（即空间编码）表明样品中存在相关的HPV亚型。
见图二
RPA引物和crRNA的设计。
图二
a 为九种HPV亚型设计的RPA引物。
b 琼脂糖凝胶结果显示用最佳引物扩增后九个靶标的RPA产物。该实验至少独立重复两次。
c 通过NGS识别9重RPA产品。
d 代表性的Cas12a相关crRNA设计用于HPV-16。
见图三
crRNA 库和多重 RPA 性能的综合表征。
图三
a 基于基质的九种crRNA对九种HPV亚型的反应性测试。基于荧光的测试结果以热图的形式进行演示。源数据作为源数据文件提供。
b 单个crRNA与九种HPV亚型反应的定量分析。源数据作为源数据文件提供。
c， d 变性 PAGE 图像显示了识别 4 重 （c） 和 9 重 （d） RPA 产物的九种 crRNA 的切割。每个实验至少独立重复两次。
e 热图显示了 4 重和 9 重 RPA 产品的基于荧光的表征。需要注意的是，c，d和e中使用的扩增子来自不同批次的RPA测定。源数据作为源数据文件提供。
f RPA引物和Cas12-crRNA设计用于多重靶标检测的拟议程序。
见图四
9种HPV亚型的<>重RPA测定的敏感性测试。
图四
a 一个方案显示，制备、扩增和测试了九个靶标中具有不同质粒浓度的一系列样品。
b 根据Cas12a测定在RPA后滴定质粒。请注意，9 重 RPA 测定（每个靶标 1× 个引物）的灵敏度为 10−17–10−18除HPV-18外的所有靶标均为M，而HPV-18的灵敏度也可以提高到10−18M在3重测定中使用18× HPV-9引物后。值表示三个独立实验的平均值±SD。未配对的双尾t检验用于显示队列之间的统计差异。源数据中提供了确切的 P 值。*P 值< 0.05，P 值< 0.01，P 值< 0.001，P 值< 0.0001。源数据作为源数据文件提供。
见图五
SS芯片性能评估。
图五
a 拼接的显微图像，显示SS-Chip的微通道和孔，带有标签。
b 用蓝色食用染料填充以模拟采样的装置的照片（顶部），以及对每个出口的体积进行相应的定量分析（底部）。
c 拼接荧光图像显示SS-Chip与荧光素（绿色）和磺酰罗丹明B（红色）的溶液混合性能。
d 拼接绿色荧光图像和相应的基于Cas12a的HPV-16检测强度分析。源数据作为源数据文件提供。
e 基于SS-Chip检测合成HPV-16质粒的动力学（阳性，10 nM;阴性，0）。
f 对应于随着HPV-16质粒浓度的增加而进行的片上测定的荧光强度。
g 分析扩增的HPV-16质粒的荧光信号。在 b 和 e–g 中，值表示 SD 和 n = 3 个生物学独立实验±平均值。在f和g中，使用未配对的双尾t检验来显示队列之间的统计差异。源数据中提供了确切的 P 值。*P 值< 0.05，P 值< 0.01，P 值< 0.001，P 值< 0.0001。源数据作为源数据文件提供。
见图六
100份患者样本的HPV感染检测结果。
图六
a 显示MiCaR与临床测定之间差异的简要示意图。临床实验室使用多重PCR进行HPV亚型测定，用于靶标扩增，颜色编码用于检测读数。同时，在MiCaR中，使用多重RPA进行扩增，使用基于微芯片的空间编码进行检测读数。
b 样品#53的测试结果对HPV亚型呈三阳性，显示为一个圆圈，显示30个出口孔的原始荧光图像。
c 使用MiCaR和临床测定法测试的样品#53结果的定量分析。值表示SD和n = 3个生物学独立实验±平均值。源数据作为源数据文件提供。
d 平行热图，显示基于临床测定和基于MiCaR的测试的100个样本的结果。使用MiCaR对每个样品进行一式三份测试。紫色箭头表示示例 #53。红色圆圈表示MiCaR与临床测定之间的不一致（样品#38和#77）。源数据作为源数据文件提供。
e 阳性预测协议（PPA），阴性预测协议（NPA），MiCaR检测临床样本中九种HPV亚型的敏感性和特异性。
见图七
使用基于 MiCaR 的方法测试 RVP。
图七
a 使用基于Cas12a的测定法对八种呼吸道病毒进行区分。（−）用作对照，其中不添加质粒。源数据作为源数据文件提供。
b 根据基于Cas8a的测定法对12重RPA产品的评价。模板是 10−12每种病毒的M质粒。（−）用作对照，其中在RPA测定过程中不添加质粒。源数据作为源数据文件提供。
c 基于 MiCaR 的读数以评估 8 重 RPA 测定。（−）用作对照，其中不添加crRNA。需要注意的是，b和c中使用的扩增子来自不同批次的RPA测定。值表示SD和n = 3个生物学独立实验±平均值。源数据作为源数据文件提供。
02
研究结论
总之，我们利用多重RPA在扩增方面的出色性能，CRISPR / Cas12a系统在靶标识别中的高特异性以及微流体装置在液体处理中的可观实用性，开发了名为MiCaR的多路复用NAT系统。
使用简单的程序和较短的测定时间，MiCaR可以检测多个靶标。与临床报告相比，MiCaR还显示出可靠和准确的检测结果。
因此，我们预计MiCaR将广泛用于一系列生物技术和医疗保健相关应用中的快速和灵敏的NAT。
好了，今天的文献解读就到这儿来，我们下期再见！如果你正在开展临床研究.需要方案设计.数据管理. 数据分析等支持.也随时可以联系我们。
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