小型模式动物整体水平筛选技术

一、小型模式动物整体水平筛选技术

近10年来,随着分子生物学技术、自动化成像技术的发展,已有大量研究人员采用线虫、果蝇、斑马鱼等小型模式动物,建立类似人类疾病的动物模型,并用于药物筛选。

(一)、小型模式动物分类

1.线虫 杆状线虫(Caenorhabditis elegans,C.elegans)与人类基因高同源性,体积较小组织透明,容易培养,生命周期较短。采用转基因技术在杆状线虫中表达荧光标记的特定疾病相关的蛋白,利用自动化荧光成像平台整合成像采集和数据分析模块定性检测线虫不同生物过程,包括生长、组织形成,细胞活力和自噬,从而可用于药物筛选。目前,线虫主要用于筛选衰老、感染、神经退行性疾病等的防治药物。

2.果蝇 果蝇(drosophila)与线虫类似,与人类基因有高度同源性,同时具有体积小、易于操作、饲养简单、成本低廉、生命周期短(约2周)、繁殖力强、子代数量多以及便于进行表型分析等多种特点。果蝇具有复杂的神经系统与脑组织,阻止药物到达中枢神经系统的屏障很弱,这也使得果蝇可用于神经系统疾病的药物筛选。但因其培养环境为固体培养,故无法在微孔板中进行,自动化操作困难。在利用果蝇建立的疾病模型涉及较多的是神经退行性疾病包括帕金森病、阿尔茨海默病、多聚谷氨酰胺病及脆性X综合征等,以及肿瘤、心血管疾病、线粒体病等。

3.斑马鱼  斑马鱼(zebrafish)是脊椎动物,其心血管系统、视觉系统、免疫系统等与人类相应系统有许多共同特点,斑马鱼的基因与人类的基因保守度达到85%。斑马鱼个体小。体长3~5cm,饲养简单便宜。胚胎透明,从完整的活体可观察到所有内部器官和结构,可多角度观察动态过程,而且胚胎生长发育快受精后24小时主要器官基本形成,便于研究组织器官的发育和功能。研究人员已在斑马鱼上模拟多种人类疾病，并用于抗血管生成、凋亡和增殖、抗炎、抗肿瘤等药物筛选。相对果蝇线虫坚硬的表皮,药物吸收困难,斑马鱼胚胎则可通过扩散来吸收药物,因此斑马鱼整体动物模型是非常合适的小分子药物筛选模型。

二、小型模式动物筛选技术特点

  由于线虫、果蝇及斑马鱼等小型模式动物具有饲养容易、个体小、繁殖快等优点,已有研究人员将其用于高通量或高内涵药物筛选操作流程可在96孔或384孔微板中进行。

  小型模式动物筛选模型检测指标相对传统动物筛选模型简单，主要包括存活率、生长状况、局部组织病理改变等。如壳质酶与受精卵孵化成幼体的行为密切相关,而神经退行性疾病常导致行为或移动缺陷，据此建立果蝇神经退行性疾病的模型根据自动化定量方式监控果蝇受精卵孵化幼体的过程或幼体的行为和移动情况通过检测撞击频率等指标考察药物的作用。SYTOX荧光染料可与受损细胞的DNA结合荧光强度的变化可反映小型模式动物死亡率。因此在筛选抗粪肠杆菌化合物的实验中，将已标记荧光染料的秀丽隐杆线虫感染粪肠杆菌,如不加抗生素其死亡率增加,使用抗生素可提高其存活率,该模型可用来筛选体外抑制粪肠杆菌复制的化合物。

  近年发展的个体自动分析系统技术为小型模式动物进行高通量筛选提供了巨大支持，如 COPAS Biosort( complex object parametric analyzer and sorter,COPAS),可根据长度、光密度、荧光信号强度等对药物作用小型模式动物后进行分选。斑马鱼的胚胎和幼体是透明的，这个特点对于利用活体成像技术实时的观测相关蛋白的表达和特定表型的(神经)细胞分布等有利，是啮齿类或其他模式脊椎动物无法比拟的。结合GFP绿色荧光蛋白标记技术,可以观察分析药物影响神经生长或突触发育的各个因素是如何发挥作用的,了解突触的生长和突触发育调节的细胞分子机制。

通过对斑马鱼心肌细胞进行荧光标记,建立了一种新的迅速评价新药对心率影响的方法,将斑马鱼放人96孔板后,自动监测心率,用于评价抗心律失常类药物的药效。也有利用自动成像技术和血管内皮细胞表达绿色荧光蛋白的斑马鱼胚胎,筛选抑制血管形成的小分子。即能在血管形成过程中特异性表达绿色荧光蛋白,呈现带有绿色荧光的血管,借助于共聚焦显微镜,便能直观、精细地观察到血管形成全过程,通过抑制血管生成活性进行评价,筛选药物抗肿瘤血管生成的作用。

  小型模式动物模型是药物整体动物水平筛选新技术的发展趋势，对于提高新药研发速度和效率将起到重要作用，将来有可能取代一些体外模型如血管生成模型等,但其目前仍然主要是作为传统整体动物模型的补充。与传统动物筛选模型相比，小型模式动物和人类基因的同源性低给药方式主要为液体给药，因此在哺乳动物模型上进行药物确证研究依然不可替代。

  无论是传统整体动物筛选模型还是新的小型模式动物筛选模型，各有其优缺点。事实上,很多疾病模型可用不同方式获得,对进行药物筛选的研究人员来说,重要的是选择的筛选技术是否能达到研究目的。正确制作或选择一个合理的整体动物筛选技术是研究新药的关键环节之一，不仅可增加科研的真实性、可信性，而且是新药研究成功率大大提高的保障。