临床前药动学研究的高通量预测方法

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一个新药开发的周期(平均12年)和费用(约10亿美元)以及成功率(1/30000~1/10 000)令人瞠目结舌,即使是上市的药物也可能因一系列原因被迫撤市。在诸多的原因中,由于ADME不得不撤市的药物在1990年多达候选药物的40%。尽管在2000年的统计结果中因为ADME 而撤市的比例降至10%以下,但是在高投入、高风险的新药研发过程中提高研发的成功率,将失败的概率降低到最小无疑是利国利民的福音。因此,在临床前药动学研究中开发高通量的 ADME 研究方法,及时发现问题,对提高新药开发的成功率,避免人力物力的浪费具有极为重要的意义。

高通量筛选及高通量ADME 研究方法

高通量筛选(high throughput screening,HTS)技术是指以分子水平和细胞水平的实验方法为基础,以微板形式作为实验工具载体,以自动化操作系统执行试验过程,以灵敏快速的检测仪器采集实验结果数据,用计算机对实验数据进行分析处理同一时间对千万样品进行检测,并以相应的数据库支持整体系运转的技术体系。

常用的筛选模型都在分子水平和细胞水平，观察的是药物与分子靶点的相互作用,能够直接认识药物的基本作用机制。高通量筛选技术与传统的药物筛选方法相比有反应体积小、自动化、灵敏快速检测、高度特异性等优点。

高通量筛选技术体系由下列内容组成:

①化合物样品库:化合物样品主要有人工合成和从天然产物中分离纯化两个来源。其中人工合成又可分成化学合成和组合化学合成两种方法。

②自动化的操作系统:自动化操作系统利用计算机通过操作软件控制整个实验过程。操作软件采用实物图像代表实验用具,简洁明了的图示代表机器的动作。自动化操作系统的工作能力取决于系统的组分,根据需要可配置加样、冲洗、温解、离心等设备以进行相应的工作。

③高灵敏度的检测系统:检测系统一般采用液闪计数器、化学发光检测计数器、宽谱带分光光度仪、荧光光度仪等。

④数据库管理系统:数据库管理系统承担样品库的管理、生物活性信息的管理、对高通量药物筛选的服务管理以及药物设计与药物发现四个主要管理功能。

在新药研发阶段常用的高通量ADME 研究方法主要有三种,即虚拟法(in silico)或称计算法(computational method)、体外法(in vitro)和体内法(in vivo)

(一)虚拟法高通量筛选

虚拟法即替代具体试验的计算机模拟法。这种方法用于早期ADME研究、具有高通量的特点。如根据以下方法可预测小肠吸收。

1.根据Lipinski五规则  又称类药五原则(rule of five)。是资深药物化学家Christopher A.Lipinski在1997年提出的筛选类药分子的五条基本法则,符合Lipinski规则的化合物会有更好的药代动力学性质,在生物体内代谢过程中会有更高的生物利用度，因而也更有可能成为口服药物。在药物研发领域Lipinski规则被用于对化合物数据库的初筛，以期摒除那些不适合成为药物的分子缩小筛选的范围并降低药物研发成本。该方法的出发点是通过化合物的结构预测口服药物在胃肠道的溶解度、解离度及跨膜吸收的能力。在化合物结构中将N和O原子看作氢键的受体,将N-H,O-H基团作为氢键的供体,通过软件计算醇水分配系数,根据下列条件判断:

①分子量小于500;

②氢键给体数目小于5;

③氢键受体数目小于10:

④脂水分配系数小于5:

⑤可旋转键的数量不超过10个。

如果一个候选物不能满足上述两个以上条件,则这个候选物将被亮黄牌警告,即其成药性有疑问。该方法的优点是便捷、利于理解和智能化,目前已经成为很多国际知名制药公司的标准筛选规则。其缺点是有局限性,有假阳性出现。利用Lipinski五规则对类药性数据库(drug-likeness database)中的记录进行测试,有76.36%的已知化合物符合Lipinski五规则。值得提及的是,该方法不适合须测有主动转运机制的口服药物。

在长期的实践过程中,药物化学家们对Lipinski规则作出简化,形成“四规则”和”三规则”,但是四规则和三规则有时仍然被称作“五规则”,这里的五,指的是各条规则的判别值均为5或5的倍数。简化后的四规则去掉了关于可旋转键的数量限制;规则进一步去掉对气键受体数量的限制。这是根据口服药物总结出的经验型规律，是小分子药物设计的有效指导原则。

2.根据Lipinski五规则+亲脂性和分子大小 该方法根据Lipinski五规则,再结合亲脂生和分子大小信息，判断候选物口服吸收时被动吸收情况。具体方法是，将候选物的内在亲脂性lgD与计算分子折射率(测定分子大小的参数)绘图,分成4个象限，如候选物位于第1第3象限,则表示候选物有适当的亲脂性，可进行跨膜转运;如在第2象限,则说明化合物的分子小、亲水性强,可通过细胞间隙吸收;若在第4象限则表示候选物分子量大、亲水性强,因此跨膜吸收困难。这种方法根据候选物所在的象限不同可对其跨膜通透性作出预测。

虚拟法高通量筛选在预测DDI方面已经取得了很大的进展,比较突出的是对CYP3A4、CYP2D6、CYP2C9等的预测。此外,虚拟法还可用来预测药物是否可通过血-脑屏障等。

据统计,目前虚拟法的预测能力可在60%~90%之间。将来还需要用更多不同结构的候选物对各种模型进行验证。此外，尚需阐明候选物在体内的ADME机制,建立机制模型进行预测。

(二)体外法高通量筛选

体外法主要有两个优点:一是可采用微量化、自动化等研究手段建立高通量模型;二是可用人体组织或细胞成分进行研究,因此具有重要的临床意义,可提高新药开发的成功率。

体外法的缺点是缺乏体内的生理、生化环境以及多种体内影响因素。比如Caco-2细胞模型是近二十几年来国内外广泛采用的一种研究药物小肠吸收的体外模型,具有方法相对简单、重复性好、应用范围较广的特点。该细胞为人的结肠癌细胞,与人小肠上皮细胞在形态学上相似,具有相同的细胞极性和紧密连接,并含有与小肠刷状缘上皮细胞相关的酶系,因此其结构和功能都类似于人小肠上皮细胞。Caco-2细胞模型现在已经成为一种预测药物在人体小肠吸收以及研究药物转运机制的标准筛选工具。美国FDA已将Caco-2细胞模型作为新药筛选模型，如新药口服吸收评价、药物研发前期化合物肠渗透性的筛选及药物小肠吸收机制研究等。但是由于Caco-2细胞的培养时间较长(一般需要培养21天)尽管有很多上述优点,但是还不能完全满足高通量筛选的条件。

(三)体内法筛选

体内法进行ADME筛选试验是一种低通量方法,即耗时、所需样品数量大、费用高。但是体内法存在体外法所不具有的生理、生化环境以及多种体内影响因素。较体外法更接近人体的生理情况,因此体内法在新药研究中是不可缺少的重要试验方法。

口服和静脉给药后测定药物生物利用度、在体小肠灌流试验等为体内研究药物吸收的方法。体内法研究 ADME时，为了提高其通量，一般采用两种方式:一是提高分析速度,这就需要高速、高灵敏的分析测试仪器,如液相色谱一质谱联用方法等;二是减少样品数量，一般可通过盒式给药(cassette dosing)的方法减少样品数量,即给动物同时服用几种药物,按常规取样时间取一次取样量就可以通过高速、高灵敏度的仪器同时检测出。该法的缺点是不能排除药物在体内发生的DDI。组合给药需要考虑每组实验的药物如何组合才利于给药和检测。

在给药方面，要求将相同或者理化性质相似的药物放在一组，以方便该组药物的溶解及给药,同时降低检测条件的摸索难度。

在分析检测方面，如果需要对血样进行质谱分析,则分子量相同或者可能产生相同分子量碎片的化合物不宜放在同一组，不同电离模式的化合物也不宜放在同一组。

另外，还应在候选药物组中加入一个已知药动学参数的化合物、用其来检测组其他化合物的药动学行为是否正常。在盒式给药法中，还有一种方式是将数个含有不同药物的样品混合后同时测定,也可以将给药后不同时间的血样等量混合来粗略估计AUC,这种方法的不足之处也是因为可能发生DDI而影响各个药物检测的准确性。

(四)高通量筛选的局限性

高通量筛选作为药物筛选以及ADME筛选的一种方法,并不是十全十美,尤其在中药研究方面,凸显了高通量筛选的局限性。

其一,高通量筛选所采用的主要是分子、细胞水平的体外实验模型,不可能替代药物在生理、病理以及体内调节因素条件下的药理作用及其机制;

其二,虽然高通量筛选技术用于快速鉴别先导化合物,但通过组合化学构建的化合物库存在结构多样性差的问题,因此降低了化合物开发的成功率;

其三,日前所建立的高通量筛选技术多数与所试验的化合物结构类别有关,因此缺乏通用性。

尽管高通量筛选技术还有不完善的地方,但是随着我们对高通量筛选技术特别是对 ADME 筛选研究的不断深入探讨,高通量筛选这一项新技术必将在未来的临床前药动学研究中发挥越来越重要的作用。