1. 背景
心血管疾病包括一系列心脏和血管疾病，包括心肌梗死、多种心肌病、心力衰竭、动脉粥样硬化、动脉瘤等，其分子生物学机制是复杂的。尽管传统的生物医学研究通过一次研究一个基因或通路带来了许多突破，但大量的潜在机制和治疗靶点仍然知之甚少。在过去十年中，高通量方法，如Bulk RNA-seq使我们能够以不断增加的分辨率研究整个转录组，极大地促进了正常或疾病状态下心脏调控网络的理解。尽管如此，其局限于反应组织平均的基因表达水平，疾病异质性很高的情况下可能会产生偏倚的结果。单细胞/核转录组测序技术（sc/sn RNA-seq）的出现克服了这一障碍，能够通过在单细胞水平评估基因表达，表征细胞异质性并检测重要的基因表达模式，发现新的标记物、配体、受体和转录因子，为进一步的功能分析提供基础。该技术以前所未有的高分辨率帮助更为深入地了解疾病机制，并帮助确定潜在的治疗靶点。本文，我们综述了单细胞转录组测序在解析稳态心血管细胞多样性和心血管疾病靶点发现中的应用，且进一步阐明scRNA-seq精准疗法研究模式以及对临床指导方面的意义。
2. 单细胞技术
图1 单细胞技术的基本流程
单细胞技术的基本流程包括样本制备，单细胞（核）捕获，RNA捕获和反转录，文库准备，测序以及原始数据处理和生信分析 （图1）。目前应用广泛的是液滴平台（10×Genomics BD）。充分的样品制备是生成可靠的单细胞转录组数据的先决条件。这一过程中要尽可能确保在组织解离前后各种细胞类型的占比以及细胞内表达谱相一致。对心血管中各类细胞而言，单核测序和单细胞测序均存在区别，系统性比较单细胞与单核技术有助于选择合适的技术。特别对于心肌细胞而言，由于成熟心肌细胞体积较大（直径＞100μm），无法通过一般的液滴平台（最大孔径为40μm），而基于平板平台（e.g. Smart-Seq2）和微流控平台（e.g. CEL-seq2）不受细胞大小限制。考虑到心脏组织中所有细胞统一的分析方式，通量和成本，另一种可替代的方法为snRNA-seq（e.g. 10×Genomics BD, DroNc-seq）。
Sc/snRNAseq数据处理包括数据比对，质控，标准化，降维聚类等。确定数据集的质量对后续生物学意义的探索至关重要，在质量控制评估期间，必须采取知情的方法，因为每个变量都可能导致误解。例如，线粒体基因的增加可能表明样品受到碎片状线粒体的污染，理论上snRNA-seq测不到线粒体基因，故snRNA-seq数据中线粒体基因数限制会比scRNA-seq更加严格（e.g. ＜5% vs ＜15%）。另一方面，高水平的线粒体转录物表达可能表明线粒体含量或活性较高。基因丰度低的细胞可能是衰老细胞群，RNA丰度高的细胞可能更大（如心肌细胞）。具有不同标记基因表达的细胞可能是过渡细胞状态，也可能是双细胞或受污染的细胞，细胞双胞体可以通过使用生物信息学分析工具来识别（e.g. DoubletFinder, scrublet）。此外，值得注意的是，在我们实验室的心肌组织的snRNA-seq经验中，非心肌细胞基本都会发生心肌细胞的背景，这是由于心肌细胞中RNA丰度高，破裂后胞质中的mRNA污染了其他细胞核。对于污染严重的数据（影响注释和差异基因分析等）需要考虑使用生物信息学工具（e.g. SoupX, Cellbender）去背景。
3. 心血管细胞异质性
图 2 心血管组织的细胞组成
稳态条件下，心脏细胞组成包括心肌细胞，成纤维细胞，内皮细胞，免疫细胞等。血管细胞组成包括内皮细胞，平滑肌细胞，免疫细胞等（图 2）。需要指出的是，即使是统一类型的细胞，也承担着不同的功能。单细胞使用无监督聚类分群，通过亚群高变基因，功能特点或者传统已发现的亚群特征对其进行注释，可以更准确地理解细胞异质性及其生物学意义。单细胞通过以下几个角度加深我们对心血管细胞异质性的认识：1.传统没有解析某类细胞异质性，使用单细胞进行无监督分群。2.传统发现某类细胞的亚群，单细胞进行识别和验证。3. 对传统发现的某个亚群的异质性进行更高分辨率的解析。4. 发现以往未发现的亚群。5. 识别细胞亚群的转录谱而并非某几个标记物。
4. 基于单细胞测序技术发现心血管疾病的潜在靶点
图 3 基于scRNA-seq发现的心血管疾病靶点汇总
单细胞技术不仅能识别出细胞异质性，在寻找疾病靶点方面也有强大的优势（图3）。除了差异基因和细胞比例分析外，通过功能分析，可以高通量识别传统生物学无法获得的信息。如通过配受体互作分析，可以推测细胞与细胞的相互作用情况。拟时分析可以模拟细胞动态变化的过程。RNA速率可预测推断未来的基因表达。转录因子分析识别细胞亚群特异性的活性转录因子。此外还有多种功能分析，为更新心血管疾病机制的认识，识别心血管疾病细胞特异性的靶点和开发靶向药物提供了潜在策略。
5. scRNA-seq与其他组学联合
图4
除转录组外，细胞复杂的生物学特性还受到多个层面的调控，包括基因、表观遗传、蛋白、代谢以及空间表达状态，各种相应单细胞组学技术也被开发，例如scDNA-seq可检测单细胞的拷贝数变异和基因突变以揭示克隆亚群和谱系，重建细胞进化过程；单细胞表观遗传组揭示基因表观水平调控，包括scATAC-seq，scDNA甲基化分析，以及scChIP-seq的组蛋白修饰，从染色质构架和开放程度分析转录调控网络；以质谱分析为基础的单细胞蛋白质组学，最直接地代表了不同细胞的功能状态。空间转录组能够反映基因表达的位置信息。scRNA-seq联合不同的单细胞技术，可以获得不同层面的信息，利于更加全面地解析疾病机制。目前应用在心血管的主要有scATAC-seq，CITE-seq，cyTOF以及空间转录组（图4）。
6.疾病靶点选择与精准疗法研究模式
图5
6.1 差异基因及差异细胞群寻找靶点（图5A，B）
寻找疾病靶点的本质是解析差异。不同的科学问题决定了不同的实验设计（疾病与健康，疾病不同阶段，病变不同程度等），这是第一维度的差异。scRNA-seq产生了以不同barcode为标签的高维数据，对其进行降维聚类和细胞亚群的精细注释后，最基本的方法为寻找不同分组中的差异细胞群及其差异基因。
6.2 功能分析寻找靶点（图5C）
在研究中，差异细胞群并不显著的情况时常出现，且scRNA-seq产生的高通量数据往往庞大，且某些差异明显的基因可能不具有与疾病相关的重要功能，而某些重要的基因又不在差异最明显的行列，此时需要通过功能分析寻找有重要功能的疾病差异。可以从三种角度和逻辑解析疾病差异：细胞，通路，分子。凸显细胞层面的功能学分析包括细胞-细胞相互作用，轨迹分析等。在通路层面，可通过通路分析和富集分析寻找生物学意义，如IPA，GO，KEGG等。分子层面，TF分析、SCENIC分析有助于识别有重要功能的转录因子。
6.3 结合其他技术寻找靶点（图5D）
可从DNA，RNA，蛋白，代谢，细胞，空间，表型出发，联合对应技术以揭示疾病机制，寻找靶点。scRNA-seq联合单细胞多组学有三个作用，首先是不同组学对同一发现不同水平的互相验证，增加了结果的可信性和准确性。第二点是可以在不同的水平有不同的发现，弥补scRNA-seq的不全面性。第三点是多组学联合可以进行靶点的上下游探索，进而为疾病发病机制提供线索。
6.4. 进行靶点功能验证和干预（图5E，F）
目前，单细胞心血管图谱研究以及描述性scRNA-seq研究的时代已经过去，在后单细胞时代，scRNA-seq有成为一项发现疾病靶点的工具和手段的趋势。在寻找到疾病靶点后，除了传统分子生物学和组织病理层面的表达验证，还需进行基于模型的功能验证，以及更大的队列中的验证和建立潜在的临床相关性。
7.临床转化
图6
7.1 临床场景应用
临床上目前已经有scRNA-seq成功进行疾病靶点发现和个体化治疗的案例，根据精准疗法模式，结合临床信息，筛选出疾病机制相关的靶点，在全面和慎重的评估下，使用药物对患者进行干预，实现挽救性、个性化医疗决策。对临床上难治，棘手的疾病，使用心血管患者的样本进行scRNA-seq，可以在诊断，风险预测，评估药物等多个层面帮助心血管病患者诊治。
7.2 转化于临床
在临床上常规实施scRNA-seq之前，必须克服许多技术、后勤和财务障碍，需要科研人员、生物信息学家、企业、医生、行政管理者的共同努力。
7.3 免疫疗法开发展望
scRNA-seq因其高分辨率和高通量，在靶点筛选方面有独特的优越性，其有助于精确识别致病亚群，进而筛选差异表达的、膜表面的、组织特异性强的标记物，实现更加精准的靶向。需要注意的是，scRNA-seq研究样本限制，靶点还需在更大的样本中验证。
8.结论
基于目前的scRNA-seq研究，我们总结了精准疗法的研究模式，这是概括性的，也是发展性的，从以scRNA-seq作为核心描述疾病的细胞特征到scRNA-seq能够作为疾病靶点发现的一种手段，深入疾病靶点上下游探索，并提出功能验证和干预方案。从单一组学到联合多组学和其他技术手段，可以进行结果的互相验证与不同水平的机制发现。描述性scRNA-seq研究时代已经过去，后单细胞时代，scRNA-seq仅是一个工具，帮助我们进行深入的机制探索。临床转化方面，scRNA-seq在制定患者个性化治疗方案，风险预测，预后分层，疗效评估方面展现出了巨大潜力，有希望成为常规的临床手段，但前提是需克服技术（精确度、可重复性、稳定性和可靠性）、操作难度（样本制备、测序流程、数据分析）、成本、后勤等障碍。免疫疗法的开发方面，我们提出了使用scRNA-seq进行CAR-T和CAAR-T靶点筛选的思路以及中和抗体筛选的流程，可能能够更好地帮助我们开发这些有潜力的疗法。随着单细胞不断发展，未来其很可能重新改变对疾病的认知以及定义患者的诊疗方式。
综述写作tips
1. 选题
选题方面，首先是看写作目的，如果目的是作为自己课题的背景调研，那么出发点应是多了解领域内研究进展，若还涉及到技术，那么要详细了解技术以及该技术本身，以便后续课题开展。再看文章撰写难易程度，选题太大太小都不好写，本文选题有点大，所以花费时间比较多。可以根据自己课题组的研究方向，缩小范围，比如单细胞在动脉粥样硬化中的应用进展，类似这种选题是相对合适的，但是也得评估选题的创新性，如果标题无法创新，那么尽量从内容创新。
2. 提纲
定题之后，可以先看看类似的框架或内容的已发表综述，制定一个初步提纲，其中尽可能回答自己这篇综述可以有的创新点是什么，我认为写作一开始的提纲不用过于缜密，大概有个思路即可，因为随着知识储备和认知的提高，对文章行文逻辑很可能发生改变。定好框架后，可以开始系统检索，可以尝试使用excel整理，如下表所示，便于后续进行整合。整理完标题后就开始大量阅读，尽量阅读和引用权威期刊。
3. 阅读与写作
阅读与写作分别是输入和输出的过程，也是相互影响的过程。写作过程中最核心还是多读文献，读懂文献，包括实验设计，逻辑思路是什么，最后的文字呈现不要纯粹堆砌结论。文章框架我也大改过几次，比如刚开始文章前面部分是按单细胞在各种疾病中应用分类的，但发现这样我的文章中只能是描述性泛泛而谈。单细胞本质意义还是能揭示细胞的异质性，故后续改成用细胞类型分类。但因为单细胞研究目前对亚群的注释还是较为主观，归纳领域普遍认可的亚群需要大量阅读。此外，阅读过程中还会遇到各种新技术、模型、分子、专有名词，开始会比较困难，但感觉科研的道路并没有捷径，得脚踏实地的去了解、弄懂。
4. 图表制作
对于图的绘制和表格的制作，建议多看看权威综述，比如Nature Reviews系列，品味很高。推荐使用的画图网站biorender，里面很多素材，非常友好，大大提高了画图的效率。以上是个人的一些鄙见，欢迎大家一起多多讨论交流。
个人感想
写综述时，阅读了当时心血管领域绝大部分的单细胞文章和大量文献，花了大量时间成稿。对话ChatGPT单细胞与心血管，他在十秒内就回答出了很多重要进展。想想目前AI暂时未告诉我的，可能是阅读完文献后整合交互后写在综述里的一些自以为是的想法吧。站在起点上，创新思维，探索科学，寻找真理，还有太长的路要走。致敬前辈，敬畏科学！
作者简介
许信杰，北京协和医学院阜外医院2021级外科学直博生，主要研究方向：心衰重构与逆重构。
小U划重点
【研究内容感悟】
综述写作是医学科研人员的必修课，完成一篇高质量的综述不仅仅是对自己前期付出的一个回馈，也会对自己后期的相关研究打下坚实的基础。本文作者在总结该综述内容的同时，也为我们分享了很多写综述的tips，科学且实用！
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