分子克隆｜第6期. 分子克隆总是问题不断该怎么解决？

质粒构建主要分为5步：载体制备，目的片段制备，载体和目的片段连接，连接产物转化和阳性克隆鉴定。我们接下来针对这5步中可能遇到的问题及对应的解决方案汇总如下：

一．载体制备

载体没有合适的酶切位点怎么办？

1）可以采用PCR反向扩增法将载体反向扩增，达到质粒线性化的目的。

2）对于有酶切位点但是因为酶切位点与目的片段的酶切位点相同而无法采用双酶切的问题，可以采用同源重组的方法进行分子克隆，效率高，可操作性强。

二．目的片段制备

1. 目的片段大不好克隆或克隆容易有突变怎么办？

PCR进行目的片段扩增时一定要采用高保真酶，对于大片段的扩增要采用兼容大片段的高保真酶，推荐TAKARA的高保真酶，可适用于10K以内的片段扩增。

2. 目的片段扩增时产物条带不特异

1）PCR引物设计的问题，可设计多对引物，选择出特异性最好的一对。

2）PCR反应条件，可考虑优化退火温度等PCR参数。

三+四．载体和目的片段连接 + 连接产物转化

阳性克隆少怎么办？

1）优化连接产物的载体与目的片段的比例，考虑增加目的片段的量。

2）适当延长载体和目的片段的连接时间。

3）连接产物转化时，热激步骤可适当延长，比如可从原来的45s延长到60-90s，切记热激时间不可过长。

五．阳性克隆鉴定

阳性克隆假阳性多怎么办？

测序前进行菌落 PCR 鉴定，鉴定引物跨区域设计，一条引物设计在载体上，另外一条在目标片段上。