图解WB | 第4期. Western blot曝光我们注意什么？

上一期我们了解western blot的曝光原理（图解WB| 第3期. Western blot曝光我们知道什么？），并且举例了在Western blot实验中常用的HRP直接偶联标记一抗的直标抗体（如内参抗体）和HRP偶联标记二抗的间接显影（如：抗兔/抗鼠二抗）。

仔细思考的同学们就会发现，Western blot是一个比较成熟的实验方法，为什么还是有不少同学在Western blot实验中的曝光这一步出现问题呢？让我们回到这一步骤的原理部分。这时候切勿心急，慢慢学，比较快。

上期我们提到Western blot曝光是酶与底物的结合反应，为了控制变量，只体现HRP标记的二抗所标记目的蛋白的差异，Western blot中的底物应是过量/足够的，HRP标记的二抗结合在目的蛋白上越多，其在化学发光仪器上的显影应是更浓的。明白了这一原理也就不难理解，为什么在显影不明显时，有建议提高抗体浓度，或是增加孵育时间，都是为了提高目的蛋白上的HRP含量。结合上一期的内容，我们总结影响HRP其含量或活性的因素。总结为两大因素：HRP活性适当/底物足够。

在规避以上可能影响HRP含量或活性以及底物含量的因素后，不少同学的Western blot条带曝光就能满足文章要求，有效规避曝光失败，但也有不少同学会遇到全部或部分条带杂乱无章（如哑铃状），背景高（膜显影蛋白以外区域黑白相间），一张膜上出现不同大小的蛋白条带（多克隆抗体/褪膜不充分），这些原因则是在曝光前的操作（如浓缩/分离胶制作、转膜步骤、抗体的选择、洗膜操作等）出现错误，则是我们下一期的讲解内容。