Bulk RNA-seq | 第6期. 火山图，不是你想的那样

本系列推送旨在带领生信零基础的科研人一起掌握Bulk RNA-seq数据分析，同时为其他Bulk组学和单细胞（核）转录组测序的数据分析奠定基础。

往期回顾

第1期. 快2024年了，还有必要学习Bulk RNA-seq？

今天我们来学习Bulk RNA-seq数据常用的一种数据可视化形式：火山图Volcano plot！与上期的框架相似，本期主要分享以下3个方面：

一、火山图的常见呈现形式？

二、为什么要用火山图（使用热图的常见目的）？

三、如何基于R生成火山图？

一、火山图的常见呈现形式？

虽然在文章中陆续看到过很多次火山图，但是如果真的要回答“火山图”有哪些常见的呈现形式，还真没那么简单。为此，我在CellPress官网中对近5年基于RNA-seq的火山图进行了检索。

然后开启手动筛选模式，（还在Nature Communication中筛选了一篇文章），最后汇总出下面一张图：

二、为什么要用火山图（使用火山图的常见目的）？

我们可以试想一下，我们在处理Bulk RNA-seq数据的时候，面对的是一个“样本-基因”矩阵，如下图：

“样本-基因”矩阵

在本系列推送的第4期（差异分析三巨头，该了解一下了），我们学习了基于上述矩阵进行差异分析，然后得到了下面的结果：

DEGs

那么问题来了：上面的表格中有7938个基因的差异分析结果，如何把这些结果通过一张图呈现出来呢？一个有用的方法就是火山图，对于火山图而言，最为重要的两个参数就是log2 (fold change)和-log10 (adjusted P value)，它们分别是火山图的横纵坐标（详细的说明，大家可以去B站“开心doctor”在2022年03月11日发布的一个视频“组学数据处理之火山图”。

结合第一部分汇总的火山图常见形式，我们基本可以推测出火山图常见的几个目的了：

1. 呈现组间差异基因的数量（包括上调和下调）

2.呈现组间关键的差异基因（不一定是最显著的，可以人为设置）

同时可以我们观察到：由于火山图的横纵坐标是确定的，所以其外观基本就确定了，但是仍然有勇于钻研的大神在“美化”方面做了改进，主要是配色方面，如颜色的选择以及设置渐变色。

三、如何基于R生成热图？

下面将以“呈现组间关键的差异基因”为目的，展示基于R的实战过程。（想获得练习数据，可在公众号输入：Bulk RNA-seq练习数据4）

1. 安装并加载R包(如果没有安装过相关R包，需要先安装，再加载)

library(tidyverse)
library(ggrepel)
library(ggplot2)

2. 加载数据（2个数据，分别是样本-基因矩阵数据、差异分析结果）

##差异分析结果（我们上次的分享内容里有计算过程）
DEGs <- read.csv("./1.数据/Bulk RNA-seq练习数据4_DEGs_with_DESeq2.csv")

DEGs

3. 可视化

##3.1 设定阈值（FC和adjP)
threshold_log2FoldChange <- log2(2)
threshold_padj <- 0.05

##3.2 明确标签：标记自己挑选的差异基因（下面只是个例子）
gene_show <- c('NPPA', 'EGR1',"WNT9A","TUBA3E")
DEGs$label <- ifelse(DEGs$gene %in% gene_show, DEGs$gene, '')


##3.3 牢记ggplot的3大要素：数据、映射、几何图形

volcano <- ggplot(data = DEGs) +
  #点
  geom_point(aes(x = log2FoldChange,y = -log10(padj),color = log2FoldChange,size = -log10(padj))) +
  #线
  geom_vline(xintercept = c(-threshold_log2FoldChange,threshold_log2FoldChange), linetype = "dashed", color = "black", size = 0.2) +
  geom_hline(yintercept = threshold_padj, linetype = "dashed", color = "black", size = 0.2) +
  #标签
  geom_text_repel(aes(x = log2FoldChange,y = -log10(padj),label = label),size = 2,
                  box.padding = unit(0.2,"lines"),point.padding = unit(0.3,"lines"),
                  segment.color = "black",show.legend = FALSE)+
  #颜色
  scale_color_gradientn(colours = c("#3288bd", "#66c2a5","#ffffbf", "#f46d43", "#9e0142"),
                        values = seq(0, 1, 0.2)) +
  #scale_fill_gradientn(colours = c("#3288bd", "#66c2a5","#ffffbf", "#f46d43", "#9e0142"),values = seq(0, 1, 0.2)) +
  #scale_color_continuous(low = '#08519c', high = '#de2d26')+
  #scale_color_continuous(values = c('#08519c','grey','#de2d26'))+
  #坐标轴
  labs(x = "log2(FoldChange)",y = "-log10(adjusted P value)",title = paste0('Down = ',table(DEGs$change)[1] ,' Up = ',table(DEGs$change)[3])) +
  #主题
  theme_bw()+
  theme(axis.text = element_text(size = 5,colour = 'black'),axis.title = element_text(size = 6), # 坐标轴标签和标题
        plot.title = element_text(hjust = 0.5,size = 6,face = "bold"), # 标题
        legend.text = element_text(size = 5),
        legend.title = element_text(size = 6),
        #legend.key.size = unit(0.1, "cm"),
        legend.position = "right",
        legend.background = element_blank(),
        legend.key = element_blank(),
        plot.margin = unit(c(0.5,0.5,0.5,0.5),"cm"))

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