突破！首个人类卵巢类器官诞生，是未来女性健康领域翻天覆地的一步!

卵母细胞发育是雌性生殖过程的核心环节，相对于其他物种，我们对人类卵母细胞发育的了解十分有限，主要因为获取人类胎儿卵巢样本存在困难，并且缺乏适用于研究人类卵巢体外发育的模型系统。

但是，得益于再生医学的发展，结合诱导多能干细胞(iPSC)技术与类器官技术，卵巢类器官在国际上已经获得了阶段性成果。今天小学社就来同大家分享一篇构建首个人类卵巢类器官的前沿文献，该类器官不仅复制了人类卵巢器官的许多关键功能，同时也标志着人类在女性生殖健康研究领域迈出了重要一步！

在卵巢的发育过程中，生殖细胞和体细胞之间的相互作用是必不可少的。其中，颗粒细胞在卵泡形成和支持卵子发生中起到了关键作用。从人诱导多能干细胞(hiPSC)中分化人原始生殖细胞样细胞(hPGCLC)已经被证实是一种有效的方法，但是如何获得颗粒细胞的问题一直没有得到解决。

因此，该研究团队创建了一种可以成功诱导颗粒细胞产生的方法：将称为转录因子（TF）的蛋白质（它们直接与DNA结合，并控制某些基因的“开”或“关”）引入hiPSC，这些转录因子将引导hiPSC分化成人类颗粒细胞。

图1 研究的实验工作流程

1. 利用带有可识别条形码的转录因子(TF)表达载体整合到hiPSC中

2. 通过筛选识别出大量表达相应条形码的前几种TF

3. 生成单克隆的hiPSC系，并高效生成颗粒细胞样细胞

4. 将诱导出的颗粒细胞样细胞与人类原始生殖细胞样细胞(hPGCLC)共培养形成全人源卵巢类器官

5. 通过免疫荧光显微镜和scRNA-seq检测，这些卵巢类器官可以产生雌二醇和黄体酮，形成卵泡样结构，并促进hPGCLC成熟

1. 预测可能引导hiPSC向颗粒细胞分化的候选转录因子（TF）

该研究团队通过以往的数据和实验总共筛选出35个TF，之后将cDNA克隆到带有条形码的目的质粒中，构建了Piggy Bac文库。

2. 过表达筛选鉴定出驱动颗粒细胞样细胞形成的TF

该研究团队通过“PiggyBac转位”技术，将35个候选TF插入到iPSC基因组中。当这些TF在iPSC中表达后，再从中筛选出哪些是驱动颗粒细胞样细胞形成的TF。为了鉴定颗粒细胞样细胞，研究人员选用了在颗粒细胞中特异性表达的FOXL2(颗粒细胞的一种标志物蛋白)，并利用CRISPR / Cas9介导的同源定向修复技术，在FOXL2的C端设计了T2A - tdTomato报告基因纯合敲入的hiPSC系。最终确定了前六个与FOXL2表达相关的TF：NR5A1、RUNX1 / RUNX2、TCF21、GATA4、KLF2和NR2F2。

接下来，研究人员测试了这些候选TF的不同组合，发现NR5A1和RUNX1、NR5A1和RUNX2这两种组合始终上调FOXL2 - tdTomato以及颗粒细胞表面标志物AMHR2和CD82的表达。

最终这些结果表明NR5A1和RUNX1或RUNX2都能够诱导颗粒细胞样表型。

图2 鉴定过表达产生颗粒细胞样细胞的转录因子( TF )

3. 基于基因表达特征的TF介导的分化驱动颗粒细胞样细胞形成

为了验证颗粒细胞样细胞的基因表达，研究人员将其进行了整体转录组分析，发现在TF诱导下，这些颗粒细胞样细胞具有双潜能性腺以及颗粒细胞标记物的表达，特别是AMHR2、CD82、FOXL2、FSHR、IGFBP7、KRT19、STAR和WNT4 (图3A )；卵巢间质/卵泡膜细胞标记物NR2F2也上调，表达水平与之前发表的颗粒细胞和人胎儿性腺的数据基本一致。

结果表明这些颗粒细胞样细胞具有类似于人类胎儿卵巢细胞的转录组。

图3 TF诱导的颗粒细胞的转录组学分析

4. 颗粒细胞样细胞对卵泡刺激素（FSH）有反应并能合成类固醇

颗粒细胞可以影响卵泡的生长启动、发育、黄体形成以及甾体激素分泌等卵巢功能活动。由于在卵巢中，卵泡膜细胞将胆固醇转化为雄烯二酮，雄烯二酮是颗粒细胞产生雌二醇的底物。限速步骤是由CYP19A1(芳香化酶)氧化脱羧生成雌酮，随后由HSD17B家族中的酶（通常为颗粒细胞中的HSD17B1）还原为雌二醇。因此在体内，雌激素合成的这一途径受到卵泡刺激素（FSH）的刺激。

根据以上机制，该研究团队用雄烯二酮处理诱导的颗粒细胞样细胞，然后添加FSH。这些细胞在不添加FSH的情况下成功地从雄烯二酮中产生雌二醇；添加FSH时，其产量增加。与此同时，这些颗粒细胞样细胞还产生了孕酮并支持卵巢内生殖细胞发育。最终结果表明人工诱导产生的颗粒细胞样细胞拥有关键的卵巢表型，包括卵泡形成和类固醇生成。

图4 颗粒细胞样细胞的激素信号传导

5. 颗粒细胞样细胞支持类卵巢内生殖细胞的发育

颗粒细胞样细胞的功能与真实颗粒细胞非常相似，研究人员发现，将这些从hiPSC诱导而来的颗粒细胞样细胞与同样从hiPSC诱导而来的人原始生殖细胞样细胞（hPGCLC）结合，能够形成卵巢类器官，帮助卵子发育。

在与hiPSC来源的颗粒细胞样细胞共培养4天后，OCT4 + hPGCLC亚群开始表达成熟的标记物DAZL （一种预示着生殖细胞开始成熟的标志物）。相反，在与小鼠细胞共培养中，直到第32天才观察到强烈的DAZL表达(图5 )。

人类生殖细胞寿命短，不足以进一步发育成卵细胞，但卵巢类器官在大约16天后就开始形成由颗粒细胞样细胞组成的空卵泡样结构（事实上没有卵细胞存在）。到第70天，卵巢类器官内形成了许多不同大小的卵泡，其中一些已经具有成熟卵泡的多层结构以支撑卵子。

图5 卵巢类器官内卵泡形成

本项研究从颗粒细胞入手，阐明了几种颗粒细胞相关转录因子的调节作用，并确定了NR5A1和RUNX1或RUNX2的过表达能够促进颗粒细胞样细胞的产生，同时证实了颗粒细胞样细胞具有类似于人类胎儿卵巢细胞的转录组，并拥有关键的卵巢表型，包括形成卵泡和合成类固醇。

更重要的是，通过iPSC技术与类器官技术结合成功构建首个人类卵巢类器官，不仅为卵巢研究奠定了基础，同时也对促进生殖医学和生物学的发展，以及改善人类健康和生命质量具有重要的意义。

尽管当下类器官领域尚处于早期阶段，但近年来随着研发热度逐渐提升，类器官技术的发展也将更加精细、深入，凭借着来源广泛、可大量扩增保持基因组稳定性、可高通量筛选、更接近生理细胞组成等优势，iPSC+类器官技术被认为是未来再生医学领域的新希望，它将为未来临床医学提供新的治疗方法和手段，为未来医学的发展开辟更广阔的前景。

参考文献：

Pierson Smela, Merrick D et al. “Directed differentiation of human iPSCs to functional ovarian granulosa-like cells via transcription factor overexpression.” eLife vol. 12 e83291. 21 Feb. 2023, doi:10.7554/eLife.83291