AUTS2基因变异与广泛的神经系统疾病相关，包括智力缺陷、小头畸形和脑畸形。通过人类大脑类器官模型研究发现，杂合子AUTS2变异导致类器官生长减少、NPC增殖缺陷和鼻咽癌紊乱。使用CRISPR-cas9基因编辑能够成功纠正变异，拯救类器官生长和鼻咽癌缺陷。另外，单细胞RNA测序揭示了AUTS2在人类皮质发育过程中NPCs的新功能，影响G1/S过渡基因表达和WNT-β-连环蛋白信号通路。总的来说，这些结果强调了大脑类器官模型在研究AUTS2综合征分子机制方面的重要性。
本文的研究方法主要是使用人类大脑类器官模型，探究AUTS2基因中的错义变异对神经系统疾病的影响，并通过CRISPR-Cas9基因编辑技术纠正这种变异。同时，还使用了全基因组测序和单细胞RNA测序等技术手段进行数据分析和结果验证。
1. 通过全基因组测序鉴定患者的AUTS2基因中的错义变异，并使用iPSCs技术将患者的细胞转化为人类诱导多能干细胞（hiPSCs）。
2. 使用CRISPR-Cas9基因编辑技术对hiPSCs进行基因修复，纠正AUTS2基因中的错义变异。
3. 使用hiPSCs培养出大脑器官模型，并对模型进行形态学和功能学分析。
4. 使用单细胞RNA测序技术对大脑器官模型中的细胞进行分析，探究错义变异对细胞类型和功能的影响。
5. 对大脑器官模型进行免疫组化染色和显微镜观察，分析细胞增殖和分化情况。
6. 对大脑器官模型进行形态学和功能学分析，探究错义变异对器官形态和功能的影响。
本研究的单细胞RNA测序分析结果显示，AUTS2基因中的错义变异可能会影响大脑器官模型中的细胞类型和功能。具体来说，与正常细胞相比，患者细胞中的AUTS2基因表达水平降低，且表达谱发生了明显的变化。此外，患者细胞中的神经元和神经前体细胞数量减少，而星形胶质细胞数量增加。这些结果表明，AUTS2基因中的错义变异可能会影响大脑器官模型中的细胞类型和功能，从而导致神经系统疾病的发生和发展。
图1 鉴定保守的富含组氨酸结构域内的在一个富含组氨酸的保守结构域内鉴定出一个新的 AUTS2 变体。(A) 家系。圆形：女性；方形：男性；填充：患病。(B 和 C）受影响个体的 MRI 显示皮层面积缩小、脑室肥大（星号）和小脑萎缩（箭头）。MRI 图像分别在矢状面和冠状面上显示。比例尺 = 2 厘米。(D) 患者外显子 9 中的 c.1600A>C AUTS2 变异的基于 Sanger 的 DNA 序列色谱图，其未受影响的健康父母中不存在该变异。(E) AUTS2 基因组结构图显示了致病变体、AUTS2 基因的关键结构域和外显子结构。截至 2021 年 1 月，ClinVar 数据库中的致病变异和可能致病的变异用圆圈表示，并根据变异类别用阴影标出。富含脯氨酸的结构域（PR1/PR2；包含无义和框移变异）和富含组氨酸的结构域（H1/H2；主要包含错义变异）来自 UniProt（条目 Q8WXX7）。来自 PFAM 的 AUTS2 蛋白家族结构域以 AUTS2 表示）。下图中的外显子位置和编号反映了典型的全长转录本（NM_015570.4）。(F) AUTS2 在 H1 结构域内和跨多个物种的 534 位的氨基酸保守性。箭头代表受影响患者的 AUTS2 T534P 变异。从头 AUTS2变体。新的AUTS2变异。
图2 AUTS2T534P 患者的 COs 显示出生长减弱和增殖缺陷。(A) 生成 COs 的方案概述。简而言之，从患者和对照组血液样本中分离出 PBMCs，并用山中因子（OCT3/4、SOX2、KLF4、c-MYC）进行仙台病毒转导以产生 iPSCs。对这些培养物进行鉴定，然后通过非定向自发分化生成 COs。A 是用 BioRender.com 创建的。(B 和 C）亲代对照 COs 和 proband COs 在第 34 天的代表性图像，显示 proband COs 的生长显著下降。比例尺 = 1 毫米。(D）亲本对照组和受试者 CO 在 CO 发育第 16 天至第 37 天的生长轨迹分析。(E 和 F）亲代对照组 COs 显示出增殖的神经祖细胞（EdU+ 和磷酸组蛋白 H3+（pHH3；有丝分裂标记）），而 proband COs 则显示出减少（在 G 和 H 中量化）。缩放条 = 50 µm。DAPI 用于染色所有细胞核（蓝色显示）。所有数据均以平均值 ± 标准差 (SD) 表示。D 中的统计分析采用 Mann-Whitney U 检验，G 和 H 中的统计分析采用单因素方差分析和 Tukey's 多重比较检验（n = 每组 4 个独立有机体，进行两次独立实验）。从第 20 天开始，亲本对照组和原癌基因组之间的差异具有统计学意义。*p ≤ 0.05; **p ≤ 0.01; ***p ≤ 0.001; ****p ≤ 0.0001。
图3 AUTS2T534P 患者的 CO 显示出神经祖细胞的功能和分子缺陷。(A) 神经祖细胞子细胞的命运与其有丝分裂类别相关。对称分裂（顶部）产生两个顶端祖细胞，而不对称分裂（底部）产生一个顶端祖细胞和一种成熟细胞类型（中间祖细胞或神经元）。A 用 BioRender.com 绘制。(B 和 C）亲本对照组和 proband rosettes 的 COs 顶端表面具有代表性的有丝分裂。分裂等级由分裂面（由 TPX2+ 有丝分裂极定义）和顶端表面（由 ZO1 标记，膜蛋白被视为大部分连续的细胞层）之间形成的锐角θa 决定。NPCs 被 SOX2 染色。低倍和高倍图像的比例尺分别为 50 和 10 µm。(D）与亲代对照组 COs（36%）相比，不对称的斜向和垂直分裂在 proband COs（65%）中比例过高。(E和F）乙酰化微管蛋白（AcTub）染色显示亲代对照组COs中的莲座状微管组织正常，但在 proband COs中组织严重破坏（G和H）。缩放条 = 250 µm。(I）亲代对照 COs 花环内的 SOX2+ 神经祖细胞在顶端表面（中央环状结构）形成粗壮、均匀的 ARLB13B+ 纤毛，而 proband COs 花环内的纤毛缩短且排列不规则（J）。缩放条 = 10 µm。(K）与亲代对照纤毛相比，原带纤毛的长度在统计学上显著缩短。所有数据均以平均值 ± SD 表示。纤毛定量数据的统计分析采用非配对 t 检验（n = 540 个亲本对照纤毛和 n = 191 个原代纤毛，每组四个独立有机体，进行一次独立实验）。****P ≤ 0.0001.
图4 使用CRISPR-Cas9编辑AUTS2T534P基因可挽救先证者COs表型。用 CRISPR-Cas9 进行 AUTS2T534P 基因编辑可挽救 proband COs 表型。(A）CRISPR-Cas9 介导的同源定向修复基因校正策略。(B）通过对受影响患者（AUTS2 c.1600A>C，疑似患者）和 GC hiPSC 株进行 Sanger 测序生成的色谱图。第一个箭头表示 c.1600 处的 C>A 碱基对变化，第二个箭头表示 c.1608 处的沉默基因编辑（G>A）。(C-G）示意图显示了从 hiPSCs 产生可重现 COs 的优化方案的主要步骤，每个步骤下方都有代表性的培养相衬显微图像。D 和 E-G 的比例尺分别为 200 微米和 500 微米。A 和 C 用 BioRender.com 绘制。(H、L 和 P）亲代对照组、 proband 和 GC 对照组 CO 第 30 天的代表性图像，K 中量化了各 CO 组的横截面积。I、M 和 Q）与亲代对照组和 GC 对照组相比， proband CO rosettes 中 EdU+ 和 phospho-Histone H3+ （pHH3；洋红色，有丝分裂标记）祖细胞的百分比降低。缩放条 = 200 µm。在 J、N 和 R 中放大，比例尺 = 50 µm；在 O 和 S 中量化。所有数据均以平均值 ± SD 表示。统计分析采用单因素方差分析和 Tukey's 多重比较检验（n = 14 个莲座丛，每组至少量化四个独立的有机体，并进行一次独立实验）。***P ≤ 0.001; ****P ≤ 0.0001; ns = 无显著性。
图5 AUTS2T534P 变体破坏了与 P300 的相互作用。(A）描述 AUTS2 与 P300 相互作用的 Duolink 近接试验（PLA）示意图。(B) CO rosettes 的代表性图像，第一列为核染色（DAPI），第二列为 PLA 信号（显示 AUTS2-P300 相互作用），第三列为合并的 DAPI 和 PLA 信号。(C) 每个细胞核 PLA 强度的量化。(D）显示 Duolink PLA 检测结果的模型，其中 AUTS2-P300 相互作用在 proband 中被破坏，导致每个细胞核的 PLA 信号强度降低。所有数据均以平均值 ± SD 表示。采用单因素方差分析和 Tukey's 多重比较检验进行统计分析（n = 每组至少有三个花环的 150 个核定量）。
图6 单细胞 RNA 测序显示，在原发性 COs 中，增殖性 NPC 的比例偏低。(A) 主要细胞类型的 UMAP 图，分为五大类：中间祖细胞、未成熟神经元和三类 NPC，共包含 17 752 个细胞。(B) 用于确定细胞簇特征的部分典型标记物。MKI67和TOP2A在1型NPC中富集表达，HOXA2和OLIG3在2型神经祖细胞中富集表达，SOX9在3型NPC中富集表达；SOX2是泛祖细胞标记；EOMES（TBR2）标记中间祖细胞；STMN2和TBR1标记未成熟神经元。(C、F 和 I）来自亲代对照 COs（8523 个细胞）、 proband COs（3754 个细胞）和 GC 对照 COs（5475 个细胞）的细胞的 UMAP 图。每幅图中都勾勒出 2 型神经祖细胞，以强调它们在 proband COs 中的代表性不足。(D、G 和 J）每组细胞类型的百分比。(E）在 2 型神经祖细胞中发现的 GO 术语富含与 G1/S 细胞周期相转变相关的基因（来源：Metascape）。(H）显示G1/S细胞周期基因在疑似患者和GC对照CO中表达的特征图。
图7 AUTS2 患者 COs 中 WNT-β-catenin 通路基因表达的缺陷。(A) 在 1 型神经祖细胞中发现的 GO 术语富含与 WNT-β-catenin 信号等相关的基因。(B) 1 型神经祖细胞中 DEGs 的 Violin 图显示了染色质修饰基因：HIST1H2AG、KCNQ1OT1 和 HMGA1；转录调节器皮质 5 层基因 TSHZ2（被鉴定为 AUTS2 靶基因）；以及与神经和胶质分化相关的基因：FGFR3、NFIB、MAP2；以及细胞粘附：CNTNAP2 也被确定为 AUTS2 的靶基因。(C) 1型神经祖细胞 DEGs 的热图显示了与 WNT-β-catenin 信号有关的基因表达变化。1 型和 3 型神经祖细胞以及未成熟神经元中 CTNNB1 基因表达的特征图和小提琴图显示，与对照组相比，探针型 COs 中 CTNNB1 基因表达减少。(D）示意图显示了 WNT-β-catenin 通路和以颜色编码的 1 型神经祖细胞 DEGs（虚线）：上调 = RSPO3、SULF2、GPC4；下调 = SFRP2、HSP90AB1、CTNNB1、ZIC1、CCND1。 E）在 3 型神经祖细胞中发现的 GO 术语富含与典型 WNT 信号通路、神经胶质细胞分化调控等相关的基因。(F) 3 型神经祖细胞中 DEGs 的 Violin 图显示，NOTCH 信号转录因子、HES1 和 ID3 调控胶质细胞分化；调控细胞分裂的基因：CENPF 和 CENPW；染色质修饰基因 HMGA1；以及 WNT 信号调节因子：RSPO3、SFRP2 和 ZIC1。(G) 在未成熟神经元中发现的 GO 术语，富含与突触成熟、胆固醇代谢、细胞骨架组织等相关的基因。(H）未成熟神经元中 DEGs 的 Violin 图显示了与突触成熟相关的基因：NEFM、RELN 和 NRXN1；胆固醇生物合成：ACAT2和HMGCS1；以及与细胞骨架组织相关的基因：与细胞骨架组织相关的基因：SMC1A 和 NEFM；以及神经元形态发生：DCC 和 MDK。值得注意的是，NRXN1（AUTS2 目标基因）、DCC、RELN（AUTS2 目标基因）和 SMC1A 也被指定为与自闭症谱系障碍和智力障碍有关的 SFARI 基因。每个小提琴图下都显示了对折变化（FC），表示相对于亲代对照或基因校正对照的对折变化。
本文的研究结果表明，AUTS2基因中的错义变异可能与神经系统疾病的发生和发展有关。通过使用CRISPR-Cas9基因编辑技术纠正这种变异，研究人员成功地恢复了大脑类器官模型的正常形态和功能。这一发现为神经系统疾病的治疗提供了新的思路和方法。
此外，本文的研究方法也为研究其他基因与疾病之间的关系提供了一定的参考。通过使用人类大脑器官模型和单细胞RNA测序技术等手段，研究人员可以更加深入地探究基因与疾病之间的关系，为疾病的治疗和预防提供更加精准的方法和策略。
参考信息
Cerebral organoids containing an AUTS2 missense variant model microcephaly.Brain. 2023 Jan 5;146(1):387-404. doi: 10.1093/brain/awac244.PMID: 35802027 PMCID: PMC9825673.
联系客服
