本研究探讨了反刍动物中常见的瘤胃上皮角化不全症（Rumen epithelial parakeratosis）的潜在机制和影响因素。该疾病由反刍动物消化道上皮角化过程的异常引起，对反刍动物的健康和生产性能产生负面影响。为了深入了解这一疾病，本文研究了瘤胃上皮细胞的异质性、分化和角化过程，以及可能导致瘤胃上皮角化病的反刍动物瘤胃代谢物。
研究者们选取了24只14天的龄羔羊，并将其分为三组，每组8只。其中，第一组仅用奶喂养，第二组用奶加苜蓿干草喂养，第三组用奶加玉米-大豆精饲料喂养。42天时，对小羊进行屠宰，收集其反刍组织进行单细胞RNA测序、免疫荧光和实时定量PCR分析，同时收集反刍液样本进行代谢组学分析。
结果显示，第三组（浓缩精料喂养）的小羊出现了瘤胃上皮角化病。单细胞RNA测序分析揭示了这些小羊从分化型角质细胞向终末分化型角质细胞（TDK）的转变过程中存在发育障碍。免疫荧光和实时定量PCR分析进一步验证了TDK标记基因的位置和表达。代谢组学分析表明，瘤胃液中的丁酸水平与瘤胃上皮角化程度呈显著正相关。此外，还成功建立了一个模拟瘤胃上皮角化过程的反刍类器官模型，并证实高剂量的丁酸确实会导致瘤胃上皮角化病。
总之，在新生羔羊模型中，通过阻断角质形成细胞的分化和瘤胃丁酸盐的过度积累，浓缩发酵可诱发瘤胃上皮角化不全。这些发现加深了对瘤胃上皮角质化的了解，并为利用早期营养干预策略解决瘤胃上皮角化不良问题提供宝贵的见解。
早期营养干预诱导不同的瘤胃上皮角质化表型
建立了三组不同的人工哺乳羔羊：只喂奶组（M）、喂奶和苜蓿干草组（MH）以及喂奶和玉米-大豆浓缩精料组（MC）。观察结果显示，引入浓缩发酵剂导致瘤胃组织受损，出血点为证。这些观察结果与瘤胃炎有关，其他组未发现。H&E切片和电子显微镜图像显示，添加浓缩发酵剂的羔羊的瘤胃上皮角质层内存在有核细胞，表明发生角化不全。
图1 不同的饲料喂养机制导致瘤胃上皮角质化的早期差异。(A) 羔羊饲喂实验流程。(B-D）瘤胃上皮的组织学检查。(E和F）角质层细胞层数和厚度。M：只喂奶的羔羊；MH：添加苜蓿干草的羔羊；MC：喂养添加浓缩精料的羔羊；SC：角质层。
单细胞 RNA 序列确定瘤胃壁细胞的异质性
研究者对三只处理羔羊的瘤胃组织进行了单细胞分析，提取活细胞并进行基因组检查。经过质量控制和细胞过滤，得到约25,789个细胞，成功确定了14个细胞群，包括上皮细胞、肌成纤维细胞、平滑肌细胞、免疫细胞和成纤维细胞（FIB）。此外，还定义了淋巴细胞和巨噬细胞等免疫细胞。这些角质细胞亚群为理解细胞分化和角质化提供了基础。
图2 Scrna-seq 分析确定了瘤胃壁细胞的异质性。(A）scRNA-seq 分析示意图（n = 3）。(B) 瘤胃组织 14 个不同细胞群的 UMAP 图。(C) 瘤胃组织的基因热图。14 个细胞簇的前 3 个基因用颜色编码并显示在右侧。(D) 各细胞群基因标记的气泡图。点的大小和颜色分别代表表达标记基因的细胞百分比和细胞簇内标记基因的平均表达量。(E) 细胞周期中不同细胞群的数量尺度叠加图（左）和每个样本中的细胞比例（右），G1、S、G2 和 M 代表有丝分裂的四个阶段。
拟时序分析揭示瘤胃上皮细胞分化轨迹和锥化
进一步研究瘤胃上皮的分化轨迹，发现FIB在皮肤重新上皮化或伤口过程中对胶原蛋白的产生起重要作用。通过模拟真实分化过程，拟时序分析揭示了瘤胃角质化与细胞命运3之间的潜在联系。在拟时序依赖性基因表达分析中，发现了2449个基因，并根据表达模式分为五个基因簇。重点分析了DK和TDK集群，发现轨迹有效地区分了这两个簇。具体来说，补充浓缩精料喂养的羔羊的DK簇主要进行早期分化，只有少数发展为TDK，表明在添加浓缩精料喂养的羔羊中，TDK的发育可能会受到影响或延迟。
图3 拟时序分析揭示瘤胃上皮细胞分化轨迹和锥化。(A-C）所选瘤胃上皮细胞群的拟时序轨迹。(D）三组的拟时序轨迹（上图）和显示拟时序内细胞集群相对丰度的叠加条形图（下图）。(E）分化命运 3 的聚类图（左）和显示不同基因簇相应生物过程的柱状图（右）。不同颜色代表不同的基因簇。(F) DK 和 TDK 在拟时序内的表达分布图（上图）和显示两个细胞集群在拟时序内相对丰度的叠加条形图（下图）。单细胞的命名和颜色与图 2B 一致。GO：基因本体
瘤胃上皮角质化过程中的细胞通讯和标记基因表达突显差异
本研究通过细胞通讯分析揭示了细胞间的通讯网络和反应机制。结果显示，FIB与多种细胞亚型关联性最强，作为配体信号细胞，而其他细胞如棘层角质细胞、DK、BAS（II、III）和间充质细胞为主要受体。这表明FIB在细胞间相互作用中起关键作用，强调了其在瘤胃上皮发育和角质化过程中的重要性。此外，CNFN的免疫染色在瘤胃乳头周围的角质层中富集，特别是在使用浓缩精料的羔羊中。
图4 瘤胃上皮角质化过程中的细胞通讯差异。(A) 所有细胞簇的细胞相互作用网络图。气泡代表细胞集群，其大小由集群间显著富集配体对的数量决定，连接两种细胞类型的线条粗细与它们的相互作用权重成正比。(B) FIB 与主要受体簇之间前 25 对配体-受体表达丰度的气泡图。(C）TDK 和 FIB 标记基因的表达分布（上）和表达水平（下）。单细胞的命名和颜色与图 2B 一致。
图5 瘤胃上皮的免疫染色突显了角质化过程。(A、B）瘤胃上皮表达的 KRT14（红色）和 KRT15（红色）的免疫染色。(C-F）TDK 和 FIB 基因标记物的免疫染色。CNFN（红色）和 DSG3（绿色）（C，D），以及 COL1A1（红色）和 COL6A3（红色）（E，F）。细胞核由 DAPI（蓝色）染色。
鉴定与瘤胃上皮角质化有关的关键瘤胃代谢物
通过代谢组学分析，研究者发现瘤胃代谢物对瘤胃上皮角质化有显著影响。与M型羔羊相比，使用浓缩精料的羔羊有110个差异代谢物，而与MH型羔羊相比，则有109个差异代谢物。分析表明，精氨酸生物合成、氨基酰-tRNA 生物合成、丁酸代谢等共有通路与瘤胃上皮角质化过程密切相关。其中，丁酸盐含量与瘤胃上皮角质层厚度和角质层细胞层数的正相关性最强。这些发现为深入研究瘤胃上皮角质化提供了重要线索。
图6 与瘤胃上皮角化相关的关键瘤胃代谢物的鉴定。(A）三组瘤胃代谢物的 PCA 图（n = 8）。(B-C) 三组瘤胃微生物代谢物的比较分析。(D）瘤胃代谢的 KEGG 通路。黄色通路代表 "M vs MC "和 "MH vs MC "之间的共有通路，蓝色代谢物代表这些通路中的共有代谢物。(E) 共享代谢物与瘤胃上皮角质化参数之间的pearson相关热图。
瘤胃上皮类器官技术验证了高水平丁酸盐导致的瘤胃上皮副角化症
研究者开发了一种瘤胃上皮类器官模型，以研究丁酸盐对瘤胃上皮角质化的影响。该模型参考了食管类器官的建立方案，当类器官大小扩展到140μm时，会出现与体内角质层相似的嗜酸性成熟角质细胞。实时PCR分析显示，随着培养时间的延长，角质层细胞标记基因的表达量逐渐增加。研究者还发现，类器官与瘤胃乳头的标记基因表达模式相似。这些发现表明，该模型有助于研究瘤胃上皮角质化过程。与对照组相比，增生的嗜酸性角质细胞并未发生去核现象，这反映了羔羊瘤胃上皮引入浓缩起动剂精饲料后的副角化现象。
该研究调查了精料浓缩引入对瘤胃上皮角化病的影响，并为瘤胃上皮发育提供了有价值的见解。研究结果表明，精料喂养导致瘤胃组织损伤和瘤胃上皮角化病的发生，其特征是角质层内有核细胞。单细胞RNA测序确定了瘤胃壁中14个独特的细胞群，揭示了细胞异质性。此外，研究还强调了过量瘤胃丁酸积累在诱导瘤胃上皮角化病中的作用。这些发现加深了我们对瘤胃上皮角质化的理解，并为通过早期营养干预解决瘤胃上皮角化病提供了潜在策略。
该研究的意义在于它对揭示瘤胃上皮角化病的机制及其对反刍动物健康的含义的贡献。通过阐明角质细胞分化的受损和过量瘤胃丁酸积累的作用，该研究为解决瘤胃上皮角化病提供了新的见解。此外，对瘤胃壁中独特细胞群的鉴定和利用瘤胃上皮类器官模型有助于全面了解瘤胃组织发育和角质化过程。总的来说，这项研究为制定早期营养干预策略以促进反刍动物生产的瘤胃健康提供了有价值的知识。
参考信息
Early concentrate starter introduction induces rumen epithelial parakeratosis by blocking keratinocyte differentiation with excessive ruminal butyrate accumulation.J Adv Res. 2023 Dec 19:S2090-1232(23)00401-0. doi: 10.1016/j.jare.2023.12.016.PMID: 38128723.
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