本研究利用一种新颖的牙周膜类器官模型，探讨了Ovatodiolide（鱼针草内酯，OVA）作为一种抗SARS-CoV-2病毒的潜在药物的可能性。研究发现，在COVID-19患者的牙周组织中可以检测到SARS-CoV-2 RNA，表明口腔可能是病毒的储存库。通过建立可靠的人类牙周膜类器官培养模型，展示了典型的上皮干细胞特征，研究深入探讨了牙齿上皮干细胞、病毒和口腔组织之间的相互作用。通过体外研究，发现Ovatodiolide能有效地结合到NRP1活性结构域，并确定了NRP1受体的b1结构域内的潜在相互作用位点。在这些位点进行点突变会影响Ovatodiolide抑制所需的浓度。体外实验表明，Ovatodiolide对SARS-CoV-2的主蛋白酶具有良好的抑制效果，EC50为7.316μM。总体而言，这项研究突显了Ovatodiolide作为一种小分子治疗药物的潜力，可以阻止病毒结合到宿主细胞上的Neuropilin-1受体，为其抗病毒机制和途径提供了深入洞察。
检测SARS-CoV-2 RNA在牙周组织中的存在：首先，研究团队检测COVID-19患者牙周组织中SARS-CoV-2 RNA的存在，表明口腔可能是病毒的潜在储存库。
建立牙周膜类器官模型：研究团队成功建立了人类牙周膜类器官培养模型，展示了典型的上皮干细胞特征，为研究牙齿上皮干细胞与病毒及口腔组织的相互作用提供了平台。
研究Ovatodiolide的抗病毒机制：通过体外研究，研究团队发现Ovatodiolide能有效结合到NRP1活性结构域，识别了NRP1受体的潜在相互作用位点。
突变分析：对潜在相互作用位点进行点突变，包括Y25A、T44A和双突变Y25A/T44A，研究这些突变对Ovatodiolide抑制所需浓度的影响。
体外实验：通过体外实验，研究团队展示了Ovatodiolide对SARS-CoV-2主蛋白酶的抑制效果，确定了其EC50值。
1、Ova是抑制 SARS-CoV-2 侵染宿主细胞的潜在药物
在早期研究中，Ova被探究为联合癌症治疗的一部分，其显著特性是能抑制人类神经丝蛋白-1（NRP1）的结合，这可能干扰SARS-CoV-2病毒侵入细胞。基于这一假设，研究人员进行了实验（如图1），专注于识别与冠状病毒相关的关键蛋白，如包膜蛋白、尖刺蛋白、核衣壳蛋白和蛋白酶Mpro。同时，模拟了Ova与NRP1的分子对接，特别关注b1结构域和疏水力的分布。图1概述了实验设计的主要步骤，包括分子对接模拟、药物筛选和体外模型验证。图1C总结了ELISA和病毒-受体结合抑制实验的结果，这对理解Ova对SARS-CoV-2的抑制机制至关重要。
图 1. ovatodiolide 的分子结构和病毒靶点以及研究设计。（A）ovatodiolide、严重急性呼吸综合征冠状病毒 2 病毒蛋白结构和疏水性表面分布图。（B）小分子药物筛选过程。（C）竞争性酶联免疫吸附试验用于确定对病毒主要蛋白酶活性的抑制。
2、Ova 抑制 SARS-CoV-2 棘突蛋白Spike 1 与人类 NRP1 受体的结合
在研究中，通过Western blot分析验证了棘突蛋白S1、ACE2和NRP1等重组蛋白的分子量，确保了实验中使用的蛋白质的完整性。竞争性酶联免疫吸附实验（ELISA）测试表明，重组棘突蛋白S1与ACE2受体的相互作用展示了生物活性，并且ACE2多克隆抗体能够阻碍S1与ACE2受体的结合。此外，实验评估了Ova在不同浓度下抑制S1与NRP1受体结合的能力，发现Ova的半最大有效浓度（EC50）为15.05μM。药物分子对接模拟结果显示，Ova有潜力结合到NRP1的b1结构域的受体结合位点，这些位点也与VEGF和尖刺S1蛋白的相互作用相关（如图2）。进一步的分析表明，Ova主要靶向NRP1的b1结构域的受体结合位点，并且对磷蛋白N-结构域的结构检查显示了潜在的治疗重要性。通过分子模拟研究确定了Ova在NRP1受体的b1结构域内的潜在相互作用位点，并通过点突变实验发现了影响Ova抑制作用所需浓度的关键位点。
图 2. Ovatodiolide (ova) 抑制SARS-CoV-2的 S1蛋白与NRP1受体的结合。(A) 三种重组蛋白的蛋白质印迹分析。(B) 棘突蛋白S1 与 NRP1 结合活性抑制分析。(C) Ova 抑制 S1 与 NRP1 的结合。(D) 人 NRP1 (b1 结构域) 的分子建模和 ova 对接。模拟 ova 在 C 端规则 (CendR) 结合位点的结合。大多数 ova 分子与人 NRP1 的 CendR 结合。人 NRP-1 (b1 结构域) 的骨架结构。(E) 点突变 NRP1 (b1 结构域) 对 OVA 抑制效果的影响。
3、Ova 在体外模型中抑制 SARS-CoV-2 的S1蛋白 与人类 NRP1 受体结合
在研究中，通过免疫印迹和细胞免疫染色方法，确认了Huh-7细胞上NRP1和ACE2受体的存在。使用荧光标记的S1单克隆抗体可监测S1与细胞受体的结合亲和力。NRP1多克隆抗体成功阻碍了S1与NRP1受体的结合，20μg浓度下可将S1的结合抑制率提高至92%（如图3）。Ova模拟在不同浓度下对S1与细胞受体结合的抑制影响，15μM浓度的Ova导致荧光信号减少近50%。假设Ova可能结合到NRP1受体的活性结合口袋，阻止S1蛋白的结合，该口袋也是VEGF的结合位点，暗示Ova可能具有多种治疗应用，包括抗病毒和抗癌治疗。
图 3. ovatodiolide (ova) 抑制SARS-CoV-2 S1蛋白 和NRP1 受体结合的体外模型。 (A 和 B) 蛋白质印迹分析和细胞荧光染色证实 Huh-7 细胞系中存在 NRP1 和 ACE2 受体。 (C) 抗 NRP1 多克隆抗体抑制尖刺 S1 和 NRP1 结合。 (D) Ova 抑制 S1 和 NRP1 结合。 (E) ova 抑制 S1 和 NRP1 结合的可能分子机制。 (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001)。比例尺：200μm。
4、Ova 对 Mpro 活性和分子对接的抑制作用
在研究中，发现Ova对SARS-CoV-2病毒的主蛋白酶（Mpro）活性具有显著的抑制作用。与已知的SARS-CoV-2 Mpro抑制剂单宁酸相比，Ova的半数最大抑制浓度（IC50）更低，为7.316 μM，显示出更强的抑制效果。通过分子对接模拟研究，发现Ova与SARS-CoV-2 Mpro之间的相互作用，特别是涉及氢键的相互作用。结果显示，Ova与Mpro的底物结合口袋内的G143和T190氨基酸建立了氢键。进一步分析表明，Ova还可以与Mpro的疏水底物结合口袋相互作用。这些研究结果共同强调了Ova对SARS-CoV-2 Mpro的潜在有效抑制作用，进一步证实了Ova可能作为抗病毒治疗的有前景候选药物。
图4. Ovatodiolide（ova）对主要蛋白酶（Mpro）活性的抑制作用及分子对接。（A）ova对Mpro活性的抑制作用。以单宁酸为阳性对照。（B）与严重急性呼吸综合征冠状病毒2 Mpro的分子建模及ova对接。（C）疏水活性位点氢键形成分析及ova结合模拟。（D）大多数ova分子与Mpro活性位点结合。（E）Mpro亚基的骨架结构。
5、Ovatodiolide (ova) 可阻断 SARS-CoV-2 的S1蛋白与NRP1 受体的体外相互作用
在体外研究中，为评估ova对SARS-CoV-2 的S1蛋白与NRP1受体相互作用的影响，研究人员使用人类牙周膜（PDL）构建了类器官，并通过详细记录的复杂培养系统图（图5A）展示了实验过程。初始阶段显示间充质标记物的存在（图5B），随后类器官发生显著变化，尤其是在将分离的牙囊整合到为牙齿衍生细胞定制的培养基（P0）后。这些类器官不仅展现出适应性，还适合后续研究传代（图5C），并表现出独特的上皮标志物以及与SARS-CoV-2刺突蛋白相容的受体。结构上，类器官具有密集的结构，由分层的立方上皮和鳞状上皮组成（图5D和E）。通过ELISA技术，研究发现ova显著抑制了病毒抗原与受体的结合，证明了其阻断SARS-CoV-2 S1蛋白与NRP1受体相互作用的能力（图5F和G）。
图 5. 离体模型说明了ovatodiolide对 SARS-CoV-2 S1 和人类神经纤毛蛋白-1 (NRP1) 受体结合的抑制。 (A) 创建源自人类牙周膜 (PDL) 的类器官，并显示类器官培养系统图。 (B) 在初始细胞培养中显示间充质标识符。 (C) 将分离的牙周膜 (PDL) 植入牙齿特异性类器官培养基 (传代 0，P0) 后，类器官形成持续成熟，并具有进一步传代的巨大潜力。 (D) 上皮类器官特异性标志物的表现。 (E) 上皮类器官中存在 SARS-CoV-2 刺突蛋白受体。形成的类器官结构紧凑，其特点是周围有一层复层立方上皮 (CE)，由细胞核与细胞质比较高的细胞组成，旁边是一层相邻的复层鳞状上皮 (SE)。 (F) 用于评估类器官中病毒抗原受体结合抑制的 ELISA 方法的示意图。 (G) ovatodiolide 对 S1 和 NRP1 结合的体外抑制。 (*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001)。 比例尺：200μm。
本研究通过探索ovatodiolide（ova）在阻碍SARS-CoV-2与NRP1受体相互作用中的潜力，提供了一种新颖的治疗途径。利用人类牙周膜 (PDL)培育的类器官为研究提供了一个独特的模型，有助于深入了解牙源细胞与病毒及口腔组织的相互作用。
研究结果表明，ovatodiolide能够干扰SARS-CoV-2的S1蛋白与NRP1受体的结合，从而可能阻止病毒进入宿主细胞。通过分子模拟和实验验证，揭示了ovatodiolide与病毒蛋白之间的相互作用机制，为其作为抗病毒药物的潜在机制提供了证据。通过对类器官模型的详细分析，揭示了ovatodiolide在阻断病毒与宿主细胞受体结合过程中的作用，为口腔健康和COVID-19相关研究提供了新的视角。
参考信息：
Hsieh MS, Chen MY, Chang YS, et al. Targeting the Neuropilin-1 receptor with Ovatodiolide and progress in using periodontal ligament organoids for COVID-19 research and therapy. Life Sci. Published online June 3, 2024. doi:10.1016/j.lfs.2024.122764
联系客服
