黑色素瘤是一种治疗难度极大的肿瘤，其具有高度异质性，导致只有少数患者对免疫疗法产生持久的治疗效果。宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院徐小威教授团队的最新研究发现，通过使用患者来源的黑色素瘤类器官模型，我们或许能够揭示免疫疗法的奥秘，为个性化治疗打开新的大门。让我们一起深入探讨这项研究成果吧！
黑色素瘤患者对免疫疗法的持久反应有限，因为黑色素瘤中存在的异质性影响了治疗效果。
传统的细胞系和动物模型在研究原发性肿瘤免疫微环境方面存在局限性。
本研究作者希望通过建立患者来源的黑色素瘤类器官模型，解决免疫疗法中的治疗抵抗机制和提高治疗效果的迫切需求。
1. MPDO模拟亲代肿瘤的特征
研究人员从患者身上获得了30个刚切除的黑色素瘤组织。在这些样本中，有73%成功形成了类器官，并通过至少一次传代验证了其细胞活力和类器官形成能力。广泛坏死肿瘤的肿瘤组织不太可能产生MPDO。部分坏死肿瘤仍可产生MPDO。大多数MPDO能够持续生长超过一个月，并且能在冷冻保存后多次传代。此外，研究发现黑色素瘤的突变状态与MPDO的形成能力无关。免疫荧光染色发现MPDO保存了肿瘤间质（图1）。
图1
2. MPDO保存了多种免疫细胞成分
为了深入了解MPDO中的免疫环境，研究人员利用免疫细胞标记物对在Matrigel或胶原凝胶中培养的MPDO进行了染色或流式细胞术（FACS）分析。结果显示，所有17例患者的MPDO中均存在多种免疫细胞类型。这些免疫细胞在MPDO中的比例因肿瘤而异，其中CD45+白细胞占所有活细胞的10%至40%。无论培养条件如何，MPDO在短期培养后（7天）均保持了与亲代肿瘤相近的免疫细胞比例。但长期培养（一个月后）则导致MPDO中免疫细胞的显著减少。这些研究结果表明，MPDO在短期培养后能够保留与亲代肿瘤相似的免疫细胞群（图2）。
图2
3. MPDO来源于黑色素瘤组织碎片
先前的研究指出，PDO可以由未经机械或酶处理的肿瘤小碎片直接培养而成，从而保持原始肿瘤的细胞结构和细胞间相互作用。为了探究小的黑色素瘤碎片是否能产生MPDO，研究团队将新鲜切除的黑色素瘤组织切成直径约500微米的片段，并在特定的类器官培养基中进行培养。培养7至14天后，观察到部分组织碎片未发生明显变化，而含有活肿瘤细胞的碎片会增大。在培养过程中，部分细胞从碎片中迁移出来。此外，不同肿瘤部位的免疫细胞百分比以及α-SMA和vimentin的表达均存在差异。因此，由小的黑色素瘤片段产生的MPDO表现出较高的异质性，且部分组织片段可能仅包含少量活肿瘤细胞。
4. 免疫抑制TME
肿瘤细胞通过上调PD-L1表达来逃避免疫系统的攻击，而PDL1也在多种肿瘤微环境（TME）细胞类型中表达。在MPDO中，通过免疫荧光和流式细胞术（FACS）分析发现，许多细胞表达PD-L1，且CD4+和CD8+ T细胞上的PD-1和CTLA-4表达与亲代肿瘤相似。然而，Treg细胞上的PD-1和CTLA-4表达，以及CD11b+、CD14+、CD15+骨髓单核细胞和CD68+巨噬细胞上的PD-L1表达在MPDO中显著高于亲代肿瘤组织。特别地，MPDO免疫细胞上的PD-1和PD-L1表达在培养14天后显著增加，表明MPDO中维持了免疫抑制的肿瘤微环境（图3）。
图3
5. αPD-1诱导TIL扩增，增加MPDO肿瘤细胞杀伤
研究人员比较了亲代肿瘤与健康供者外周血中CD8+ T细胞上检查点蛋白的表达，发现肿瘤浸润性CD8+ T细胞中这些检查点蛋白水平显著升高。随后，研究者通过体外实验探讨了αPD-1（派姆单抗）和IL-2对MPDO中CD8+ T细胞增殖的影响。结果显示，αPD-1与IL-2联合使用显著增加了MPDO中CD3+和CD8+ T细胞的数量，并诱导了显著的T细胞增殖，同时降低了活的肿瘤细胞数量。FACS分析进一步验证了这一发现，显示αPD-1 + IL-2治疗促进了CD3+、CD4+和CD8+ T细胞的增殖，并降低了CD4+/CD8+ T细胞的比例。此外，αPD-1 + IL-2治疗增强了MPDO中肿瘤细胞的死亡和凋亡（图4）。
图4
6. 免疫治疗采用αPD-1和IL-2扩大TIL
尽管自体肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）与高剂量IL-2的过继细胞疗法（ACT）在黑色素瘤患者中展现出疗效，但提高治疗反应率和持续时间仍是挑战。研究人员发现，在TIL扩展过程中加入αPD-1不仅增加了CD8+ T细胞的数量，而且降低了PD-1+或PD-1+ Tim-3+的表达，并提高了IFN-γ的产生，表明αPD-1的加入可能优化了TIL扩增。通过模拟细胞外基质环境，利用嵌入胶原凝胶的黑色素瘤患者来源的MPDO评估TIL的趋化性、迁移和浸润能力，以及肿瘤杀伤能力。结果显示，IL-2 + αPD-1或IL-2 + αCD3扩增的TIL表现出更强的运动性和浸润能力，以及更高的肿瘤杀伤效率，提示IL-2 + αPD-1可能是优化TIL治疗黑色素瘤的有效方法（图5、6）。
图5
图6
7. 小分子筛选以确定增强TIL功能的化合物
通过一系列的小规模筛选，涉及多种抑制剂如PI3K、Bcl-xl、BCR-ABL、CDK、PARP、HDAC、CXCR4、CXCR2、FGFR和CSF-1R等，研究人员使用这些化合物在三名患者的基质中培养的MPDO中进行了剂量反应研究。实验结果显示，当化合物浓度等于或大于1μM时，能显著抑制MPDO中的细胞活力。此外，不同患者的MPDO对这些化合物的反应存在差异，其中Copanlisib和Palbociclib表现出较优的抗肿瘤效果。进一步的研究发现，Navitoclax、AZD8186、Palbociclib和Talazoparib在多数情况下能增强TIL对MPDO的细胞毒性（图7）。
图7
本文介绍了患者来源的黑色素瘤类器官模型在评估免疫疗法中的重要性。由于黑色素瘤存在着肿瘤内外的异质性，仅少数患者对免疫疗法产生持久的治疗效果。因此，研究人员迫切需要合适的临床前模型来探究耐药机制并提高治疗效果。研究人员指出，类器官模型能够更好地模拟患者的肿瘤微环境，有助于研究耐药机制和优化治疗策略。他们还提到，这些模型可以用于测试免疫检查点抑制剂、细胞治疗和靶向治疗等不同类型的治疗方法。总的来说，这些患者来源的类器官模型为研究人员提供了一个更贴近实际临床情况的平台，有助于推动黑色素瘤治疗领域的进步。
参考文献
Ou L, Liu S, Wang H, Guo Y, Guan L, Shen L, Luo R, Elder DE, Huang AC, Karakousis G, Miura J, Mitchell T, Schuchter L, Amaravadi R, Flowers A, Mou H, Yi F, Guo W, Ko J, Chen Q, Tian B, Herlyn M, Xu X. Patient-derived melanoma organoid models facilitate the assessment of immunotherapies. EBioMedicine. 2023 Jun;92:104614. doi: 10.1016/j.ebiom.2023.104614. Epub 2023 May 23. PMID: 37229906; PMCID: PMC10277922.
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