为大家解读题为“Microfluidic space coding for multi plexed nucleic acid detection via CRISPR - Cas12a and recom binase poly merase amplifi cation”的研究工作中文翻译为通过CRISPR-Cas12a和重组酶聚合酶扩增编码多重核酸检测的微流控空间的文章。
研究背景
多种核酸的快速、廉价和多重检测对人类健康非常重要，但这仍然是一个巨大的挑战。在此，我们提出了一个名为MiCaR的核酸测试平台，它将大音阶的第三音带有CRISPR的微流控设备Cas12aand多路复用r酶聚合酶扩增。
只有一个荧光探针，MiCaR可以通过微流控空间编码同时测试多达30个核酸靶。检测限达到0.26阿托摩尔，多重检测仅需40分钟。我们通过有效检测9价HPV疫苗靶向的9种人乳头瘤病毒亚型证明了MiCaR的效用，在对100名有人乳头瘤病毒感染风险的患者样本的测试中显示出97.8%的灵敏度和98.1%的特异性。
此外，我们还通过成功测试八种最具临床相关性的呼吸道病毒，展示了我们方法的可推广性。我们预计这种有效、简单和通用的平台将广泛用于多重核酸检测。
图一
MiCaR平台的原理。
基于MiCaR的人乳头瘤病毒子分类策略示意图。
图一
a-子类型化过程中所涉及的步骤的简要概述。首先热解收集的宫颈细胞样品。然后，进行RPA以扩增9种人乳头瘤病毒亚型。随后通过微流体装置上的CRISPR-Cas12a系统测试扩增子，随后通过荧光成像获得读数。
b-片上测试原理。使用30个多路星形芯片(SS芯片),其中一个中心入口连接到30个出口。出口预装了各种识别相关靶人乳头瘤病毒亚型的cas 12a/crrna。在芯片上分析后，特定出口处的荧光读数(即空间编码)指示样品中相关人乳头瘤病毒亚型的存在。
图二
人乳头瘤病毒面板的底漆和crRNA设计。
图RPA引物和crRNAs的设计。
图二
a-九种人乳头瘤病毒亚型的RPA引物设计。
b-琼脂糖凝胶结果显示用最佳引物扩增后9个靶的RPA产物。该实验独立地重复了至少两次。
c-通过NGS鉴定9-复合RPA产物。
d-为人乳头瘤病毒-16设计的具有代表性的Cas12a相关的crRNA。
图三
九种人乳头瘤病毒亚型的crRNAs和RPA引物的验证。
图crRNA库和多重RPA性能的综合表征。
图三
a-九种crRNAs对九种人乳头瘤病毒亚型的基于基质的反应性试验。基于荧光的测试结果显示为热图。源数据作为源数据文件提供。
b-单个crRNAs与九种人乳头瘤病毒亚型反应的定量分析。源数据作为源数据文件提供。
c, d-变性PAGE图像显示识别4-plexed(c)和9-多路复用(d)RPA。每个实验至少独立重复两次。
e-热图显示了基于荧光的4-和9-plexed RPA产物的特征。需要注意的是，c、d和e中使用的扩增子来自不同批次的RPA分析。源数据作为源数据文件提供。
f-用于多重靶检测的RPA引物和Cas12-crRNA设计的建议程序。
图四
与病史相关的USC鉴别方案。
来源于恢复期小鼠的分化尿路上皮维持体内观察到的差异转录组。
图四
a-通过显著差异表达基因的USC RNA-seq的PCA显示，样品通过细胞系(以前的感染结果)聚类。
b-40个差异表达基因(deg)在致敏与未致敏之间以及致敏与消退的USCs之间重叠。表中列出了前15个重叠deg。
c-分化的尿路上皮RNA-seq的PCA显示了根据细胞系(以前的感染结果)和继发感染状况的聚类。
d的火山图，比较模拟感染的致敏与已解决的分化尿路上皮。FC >0.5的DEGs，P形容词 <0.05 are indicated as red dots.
e-途径分析用于评估在模拟感染的致敏细胞中，相对于已解决的分化尿路上皮细胞，差异表达基因丰富的生物途径。使用右尾费希尔精确检验确定显著性，其中P形容词 < 0.05 being considered as significantly enriched pathways. Shown are selected pathways with z-得分> 2且–log(P值)> 4.2。模拟感染和UPEC感染的分化尿路上皮细胞之间的通路重叠(扩展数据图。8d)都加了下划线。
f-的热图显示了程序性细胞死亡相关基因在模拟感染的未分化、分化和致敏分化尿路上皮中的差异表达。使用Wald检验确定DEGs的显著性，然后使用Benjamini-Hochberg FDR进行多重检验校正P价值。
图五
SS芯片和MiCaR检测系统的特性。
SS芯片性能评估。
图五
a-显示SS芯片的微通道和孔的拼接显微图像，带有标签。
b-装有蓝色食用色素以模拟取样的设备照片(上图)，以及每个出口(下图)中体积的相应定量分析。
c-拼接荧光图像显示了SS芯片与荧光素(绿色)和磺基罗丹明B(红色)的溶液混合性能。
d-基于Cas12a的人乳头瘤病毒-16测试的拼接绿色荧光图像和相应的强度分析。源数据作为源数据文件提供。
e-基于SS芯片的合成人乳头瘤病毒-16质粒检测的动力学(阳性，10nM；负数，0)。
f-荧光强度对应于随着人乳头瘤病毒-16质粒浓度的增加而进行的芯片上分析。
g-扩增人乳头瘤病毒-16质粒的荧光信号分析。在…里b和e–g，值代表平均值SD和n= 3个生物学独立的实验。在…里f和g，不成对的双尾t-测试用于显示群组之间的统计差异。确切的P-源数据中提供了值。*P-值< 0.05，**P-值< 0.01，* * * *P-值< 0.001，并且****P-值< 0.0001。源数据作为源数据文件提供。
图六
使用MiCaR系统对患者样本进行人乳头瘤病毒分型。
100个人乳头瘤病毒感染患者样本的检测结果。
图六
a-显示MiCaR和临床检测之间差异的简要示意图。临床实验室使用多重PCR进行人乳头瘤病毒分型分析，以进行靶扩增，并对检测读数进行颜色编码。同时，在MiCaR中，多重RPA用于扩增，基于微芯片的空间编码用于检测读数。
b-对于人乳头瘤病毒亚型为三阳性的样品#53的检测结果显示为一个圆圈，显示了30个出口孔的原始荧光图像。
c-使用MiCaR和临床检测对样品#53的结果进行定量分析。值代表平均值SD和n= 3个生物学独立的实验。源数据作为源数据文件提供。
d-平行热图显示了基于临床化验和MiCaR测试的100个样本的结果。使用MiCaR对每个样品进行三次测试。紫色箭头表示样品#53。红圈表示MiCaR和临床分析之间的不一致(样品#38和#77)。源数据作为源数据文件提供。
e-阳性预测一致(PPA)、阴性预测一致(NPA)、MiCaR检测临床样本中9种人乳头瘤病毒亚型的敏感性和特异性。
图七
用呼吸道病毒小组测试MiCaR的可推广性(RVP)
用基于MiCaR的方法测试RVP。
图七
a-使用基于Cas12a的试验区分八种呼吸道病毒。()用作对照，其中不添加质粒。源数据作为源数据文件提供。
b-基于基于Cas12a的分析对8-plexed RPA产品进行评估。模板是10−12每种病毒的m质粒。()用作对照，其中RPA分析期间不添加质粒。源数据作为源数据文件提供。
c-基于MiCaR的读数，用于评估8-plexed RPA分析。()用作对照，其中不添加crRNA。需要注意的是，用于b和c来自不同批次的RPA分析。值代表平均值SD和n= 3个生物学独立的实验。源数据作为源数据文件提供。
研究结果
总之，我们开发了一个名为MiCaR的多路NAT系统，利用了多路RPA在扩增方面的出色性能、CRISPR/Cas12a系统在目标识别方面的高特异性以及微流控设备在液体处理方面的显著效用。
使用简单的程序和较短的分析时间，MiCaR可以检测多个目标。与临床报告相比，MiCaR也显示出可靠和准确的检测结果。因此，我们预计MiCaR将广泛用于生物技术和医疗保健相关应用的快速灵敏NAT。
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