杂交瘤细胞的染色体分析protocol

  正常小鼠脾细胞的染色体数目为40，小鼠骨髓瘤细胞SP2/0为62-68，NS-1为54-64，一般来说，杂交瘤细胞染色体数目较多且较集中，其分泌能力则高，反之，其分泌单抗能力则低。
  检查杂交瘤细胞染色体的方法最常用秋水仙碱法，其原理是应用秋水仙碱特异的破坏纺锤丝而获得中期分裂相细胞；再用0.075mol/L KCl溶液等低渗处理，使细胞膨胀，体积增大，染色体松散；经甲醇-冰醋酸溶液固定，即可观察检查。其操作步骤如下：
1、开37℃水浴锅，放入低渗液预温，同时将干净载玻片-20℃预冷。

2、瓶内取细胞至6孔板中培养，一孔一样品，第二天加入终浓度为0.4—0.8ug/ml秋水仙碱(-80℃冻存有浓度200 ul/ml的秋水仙碱，并分装为80ul/支，用时可视六孔板孔内培养液多少加入相应量的秋水仙碱，4ul分装好的秋水仙碱/ml培养液，即孔内有4ml培养液加入16ul分装好的秋水仙碱，终浓度为0.8ug/ml)，继续培养4—6小时，  吹打均匀，吸至10ml管中，1000r/min×10min，弃上清，离心期间配制固定液（甲醇与冰醋酸3：1混合）100ml。

3、 加入已预温到37℃的0.075mol/L KCl溶液5ml，将沉淀细胞悬浮并混匀，37℃水浴15-20分钟。
4、 向悬液中加入新配制的固定液1ml，混匀，然后1000r/min 10分钟，弃去上清液（可留少量液体）；本步骤的目的是使细胞表面轻微固定，可防止固定后细胞粘连成团块。
5、 贴壁缓慢加入固定液5ml，将细胞悬浮并混匀，室温静置20-30分钟，然后1000r/min 10分钟，弃去上清液；重复操作一次；其后加5ml固定液，将细胞悬浮并混匀。
6、1000r/min 5分钟，轻轻吸去上清液，根据细胞压积多少而留下0.5-1ml固定液，将细胞悬浮并混匀后，吸取细胞悬液1-2滴，滴在刚从冰水中取出的载玻片上，用口吹散，并在火焰上通过数次，使细胞平铺于载玻片上，自然干燥。
7、 用新配制的10% Giemsa染液染色10-20分钟，然后用自来水洗去染液，自然干燥。（Giemsa染液配方：Giemsa粉0.5g，甘油33ml，55-60℃保温2小时，加甲醇33ml混匀，保存于棕色瓶内作为原液；取原液1份，加1/15mol/L PH6.8 PBS 9份，即成10% Giemsa染液）。
8、 镜检：选择染色体分散好，无重叠，无失散的细胞进行观察分析。每份标本应计数100个完整的中期核细胞，并注意观察是否有标志染色体。