一、 亲本细胞
1. 骨髓瘤细胞
NS-1骨髓瘤细胞(1976年kohler)：小鼠骨髓瘤细胞株P3-NS1-1-Ag4-1（简称NS-1)，染色体数为57，来源NS1/1是小鼠骨髓瘤P3（MOPC21）细胞系的亚系，P3细胞分泌IgG1(K)。NS1/1细胞不合成重链（rl），只合成而不分泌轻链（K）。NS-1骨髓瘤细胞是NS1/1的亚系，既不合成免疫球蛋白重链，也不分泌免疫球蛋白轻链，增殖速度很快，融合率很高，抗8-Ag(8-氮杂鸟嘌呤，20μg/mL)，在HAT培养液中死亡，是常用的小鼠骨髓瘤细胞株，保存在液氮中。
2. 免疫亲代细胞
经抗原免疫的鼠脾B淋巴细胞。
抗原免疫方法：
动物的选择：纯种BALB/C小鼠，6～8周龄，体重18～20g，均为雌性。
免疫方案
初次免疫：腹腔和下肢0.3mL
↓1周后
第2次免疫：腹腔和下肢0.3mL
↓1周后
第3次免疫：腹腔和下肢0.3mL
↓1周后
第4次免疫：腹腔和下肢0.3mL
↓1周后
第5次免疫：腹腔和下肢0.3mL
↓1周后
第6次免疫：腹腔和下肢0.3mL
↓三天后
加强免疫（融合前三天）尾静脉 0.2mL
二、 细胞融合
末次免疫后第3天取脾制成细胞悬液，与骨髓瘤细胞按一定的比例混合并在融合剂作用下按常规法方法进行细胞融合。
1. 饲养细胞制备
在制备单克隆抗体过程中，许多环节需要加饲养细胞，如：在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中，加入饲养细胞是十分必要的。常用的饲养细胞有：小鼠腹腔巨噬细胞、小鼠脾脏细胞。
采用与免疫小鼠相同的品系，常用BaLb／c小鼠或昆明小鼠6～10周龄
↓
拉颈处死 浸泡于75％酒精，消毒3～5分钟
↓
用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜
↓
取脾
↓
反复冲洗，吸出冲洗液
↓
放入10mL离心管，1200转／分离心5～6分钟
↓
用20％小牛血清(NCS)或胎牛血清(FCS)的培养液混悬，调整细胞数1×10５／mL
↓
加入96孔板，100μl／孔
↓
放入37℃ CO2孵箱培养
一般饲养细胞在融合前一天制备，一只小鼠可获得5～8×106腹腔巨噬细胞，若用小鼠脾细胞做饲养细胞，浓度为1×106个/mL。
2. 骨髓瘤细胞
骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤细胞在同一品系小鼠腹腔内产生大量McAb。骨髓瘤细胞的培养适合于一般的培养液，如RPMI1640，DMEM培养基。小牛血清的浓度一般在10～20％，细胞的最大密度不得超10６/mL，一般扩大培养以1∶10稀释传代，每3～5天传代一次。细胞的倍增时间为16～20小时，NS-1骨髓瘤细胞系为悬浮或轻微贴壁生长，只用弯头滴管轻轻吹打即可悬起细胞。
一般在准备融合前的两周就应开始复苏骨髓瘤细胞，为确保该细胞对HAT的敏感性，每3～6月应用8-AG(8氮杂鸟嘌呤)筛选一次，以防止细胞的突变。
保证骨髓瘤细胞处于对数生长期，良好的形态，活细胞计数高于95％，也是决定细胞融合的关键。
3. 免疫脾细胞
免疫脾细胞指的是处于免疫状态脾脏中B淋巴浆母细胞。一般取最后一次加强免疫3天以后的脾脏，制备成细胞悬液，此时B淋巴母细胞比例较大，融合的成功率较高。
脾细胞悬液的制备：在无菌条件下取出脾脏，用不完全的培养液洗一次，置脑瓶中，用镊子研磨成细胞悬液后计数。一般免疫后脾脏体积约是正常鼠脾脏体积的2倍，细胞数为2×10８左右。
4. 细胞融合，选择杂交瘤
(1) 细胞融合流程
① NS-1细胞的准备：融合一次需要2-3瓶细胞（100mL）。轻摇使细胞转移至50mL离心管，于700rpm，离心7min。弃上清，用单纯1640约40mL重悬，700rpm，再离心7min。（NS-1洗涤离心2次）
② 脾淋巴细胞的准备：取72h前免疫的BALB/c小鼠，摘除眼球采血，并分离血清作为抗体检测时的阳性对照血清。通过颈脱位致死小鼠，浸泡于75%酒精中5-7分钟，在超净台中用无菌手术剪剪开腹部皮肤，看到脾脏，换眼科剪镊，剪开腹膜，取出脾脏，将脾周边剪5-6下，放入100mL烧杯中，加单纯1640约4小巴氏，然后用大镊子边搅动边夹脾脏，待脾至透明薄膜状，将脾包膜取出。
③ 将上层脾细胞转至50mL圆底离心管，待剩余少部分时，补加1小巴氏单纯1640重悬，吸上清至50mL圆底离心管。
④ 取离心后的NS-1细胞，用单纯1640（3-4小巴氏）重悬，与脾细胞混合，补加单纯1640至40mL左右，1000rpm，离心10min。
⑤ 取PEG（0.6g于青瓶灭菌）在酒精灯上烧至融化，加0.6mL单纯1640，混匀。
⑥ 取离心后的50mL离心管，弃上清，在手掌上轻击融合管底，使沉淀细胞松散均匀，置40℃水浴中预热。
⑦ 用1mL吸管在2分钟内缓慢滴加50% PEG 1mL，边滴加边轻轻摇动。 然后用1mL吸管在1分钟内滴加1mL单纯1640，边滴加边轻轻摇动，重复加入1mL单纯1640 1次。然后在30秒内滴加1mL单纯1640，重复滴加1次；最后补加单纯1640约至40mL，于500rpm，离心6 min。依次加入，详见下表：
加入
缓慢滴加，边加边轻摇
限时
第一步
PEG
50% PEG 1mL
2分钟内
第二步
单纯1640
1mL单纯1640
1分钟内
第三步
单纯1640
1mL单纯1640
1分钟内
第四步
单纯1640
1mL单纯1640
30秒内
第五步
单纯1640
1mL单纯1640
30秒内
第六步
单纯1640
单纯1640约至40mL
第七步
于500rpm，离心6 min。
⑧ 取96孔板，每孔加入2滴含HAT的完全1640培养液，每次融合4板，同时做NS-1对照孔（1竖列）。
⑨ 取离心后的融合管，弃上清，于手掌轻敲几下，加入HAT完全1640约4小巴氏，轻轻吹打几下，再补加至30mL左右（根据96孔板数），反复轻吹打几下，每孔1滴加入已含有HAT完全1640的96孔板中。
⑩ 用皮套将96孔板勒紧，放置37℃、6.5%CO2培养。于第四天镜下观察融合情况，进行换液，于第七天进行单抗初筛。
(2) HAT筛选杂交瘤
因为在培养板内已加入饲养细胞、融合后的细胞，200μl／孔。所以在加选择培养液时应加3倍量的HAT。
一般选择HAT选择培养液维持培养两周后，改用HT培养液，再维持培养两周，改用一般培养液。
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