学会Cre-loxp系统，在我导面前露一手

写在前面，需要该系统质粒的可以私信小编。

Cre-loxp系统介绍：

Cre/Loxp重组系统由Cre重组酶和Loxp位点两部分组成，Cre重组酶基因来源于大肠杆菌噬菌体P1，由343个氨基酸组成，具有催化活性，而且和限制性内切酶差不多，能够识别回文的DNA序列，叫做Loxp位点，从而介导基因重组。Loxp位点长34bp，loxp位点序列是：ATAACTTCGTATA-GCATACAT-TATACGAAGTTAT，包括两个13 bp的反向重复顺序和8bp的间隔序列。

有意思的是：根据Loxp序列的方向，可以产生三种不同的结果。（1）如果两个loxp位点在同一条染色体上，并且方向相同，就会删除loxp位点之间的序列。（2）如果两个loxp位点在同一条染色体上，但是方向相反，就会颠倒loxp位点之间的序列。（3）如果两个loxp位点在不同的染色体上，并且方向相同，就会交换（也称易位）两条染色体上的两个loxp位点之间的序列。

先以cre-loxp系统检测细胞融合为例：

原理和步骤：

cre-loxp系统检测细胞融合需要两个质粒：一个质粒表达cre重组酶，另一个质粒携带loxp-stop-loxp-Fluc（简写loxp-stop-Luc）。操作其实挺无脑的，准备两盘细胞，一盘细胞（A）转染cre重组酶表达质粒，另一盘细胞（B）转染loxp-stop-Luc质粒。然后把两盘细胞（A+B）混在一起，感染能够引起细胞融合的病毒、假病毒或者转染能够引起细胞融合的质粒等。当A细胞和B细胞发生融合时，A细胞表达的Cre重组酶就能够对B细胞中的loxp-stop-Luc进行重组，从而删除STOP这个“终止盒”，因此loxp-stop-loxp下游的Luc基因才能表达。这个原理就是应用了上面提到的如果两个loxp位点在同一条染色体上，并且方向相同，就会删除loxp位点之间的序列。通过检测Luc信号来定量细胞融合程度。Cre重组酶激活基因表达的具体原理看下面那张图，吧“Gene of Interest”当成Luc（荧光素酶基因）来看就明白了。这个系统里把Luc换成EGFP也可以，比光镜下看合胞体要容易并且准确一些。

拓展应用：

1. 用于筛选或评价药物是否能抑制病毒感染诱导的细胞融合，进而评价药物的抗病毒作用。

2. 比较不同突变株病毒诱导细胞融合的能力，从而比较病毒入侵特定细胞的能力。

3. 筛选或评价单克隆抗体阻断病毒诱导细胞融合的能力，从而评价抗体的抗病毒作用。
   

CRE重组介导的Lox-Stop-Lox基因激活原理（Sergio Y Alcoser and Melinda Hollingshead. 2011）

Cre-loxp系统的其他应用也很多，比如：

（1）基因表达调控。上面说的cre-loxp系统检测细胞融合，就是通过Cre重组酶删除“stop”终止盒，从而启动luciferase的表达。

（2）基因敲除小鼠。目前大家看到的条件性敲除小鼠flox小鼠，就是在要敲除的基因两端插入loxp位点。然后把这个小鼠和组织/细胞特异性cre小鼠交配，表达Cre的组织/细胞就能删除loxp位点之间的基因。这个的好处是可以只在某种组织/细胞中敲除某个基因，但是不影响其他的组织/细胞。

基于cre-loxp的基因敲除又能衍生出诱导型敲除，切入点就是诱导表达Cre重组酶。最常见的就是tet-on和tet-off系统了。tet-on原理就是用四环素（Dox）激活rtTA（反式四环素转录激活因子），激活的rtTA结合并激活TRE（四环素响应元件），激活的TRE就能诱导Cre重组酶的表达。tet-off原理和tet-on相反，没有四环素的时候，激活的tTA结合并激活TRE，这时候Cre能够表达。添加四环素的时候，tTA就被灭活了，Cre就不能表达了。做过诱导表达细胞系的家人就秒懂了。四环素可以通过饮水喂给小鼠，这样就能在不同发育阶段实现基因敲除了。

（3）基因插入。首先在基因组上构建两个loxp位点，这样两端带有loxp位点的外源基因，就能和基因组上的两个loxp位点之间的基因发生重组，从而把外源基因插入小鼠基因组内，同时把小鼠基因重组出来，起到了类似于基因置换的作用。

（4）基因易位。原理也很简单，就是在两条不同的染色体上构建loxp位点（loxp方向要相同），然后在Cre重组酶的作用下，loxp位点之间的基因发生易位，这样就能把某个基因从1号染色体易位到2号染色体上去。

（5）基因颠倒。在目的基因两端构建方向相反的loxp位点，在cre重组酶作用下，目的基因就能方向反方向颠倒了。

基于cre-loxp的原理，大家可以灵活运用，自由发挥的空间很大。以病毒学研究为例，如果想要研究两个病毒的共感染，就可以在A病毒上插入Cre重组酶基因，在B病毒上插入loxp-GFP-loxp。这样被两个病毒共感染的细胞才能表达GFP，就能通过流式筛选出共感染的细胞，然后通过组学之类的技术比较共感染的细胞和只有A病毒感染或只有B病毒感染的细胞有什么差异。