使用秸秆生产柠檬酸的废弃物制备牛蒡生物有机肥的方法与流程

本发明涉及微生物发酵生产有机肥技术领域，具体涉及使用秸秆生产柠檬酸的废弃物制备牛蒡生物有机肥的方法。

背景技术：

当前资源节约和环境保护已成为我国发展的基本国策，绿色生态也成为现代农业发展的内在要求，随着我国对农产品质量和农业可持续发展要求的不断提高，人们对农业生态环境的保护愈加重视，环境友好型肥料受到日益关注，已经逐渐成为我国肥料发展的主流趋势。

在徐淮地区沛县、丰县交界处的土质多为中性沙壤土，土层深厚，土壤疏松，排灌水方便，正是牛蒡作为深根茎类蔬菜适宜生长的土壤类型，徐淮地区牛蒡种植约占全国牛蒡面积的50％，并且区域集中，种植和管理技术成熟，但是随着在牛蒡种植中常年使用化学肥料破坏了土壤的生态环境，致使逐渐产生了土壤板结及病虫害增加的现象，从而使牛蒡产量下降及质量降低。

在申请号为cn105886556a的发明专利中，公开了一种混菌发酵农作物秸秆生产柠檬酸的方法，其通过以纤代粮，利用水稻秸秆发酵生产柠檬酸，混菌发酵中的菌种包括：黄孢原毛平革菌、里氏木霉及黑曲霉，虽然实现了由水稻秸秆发酵生产柠檬酸的目的，但是在发酵结束后每生产1吨柠檬酸伴随产生10-15m³有机废水，这些废水中含有大量的糖分和还原性物质，其具有cod(还原性物质的物质的量)浓度高(10000m份/l以上)、ph值低3.5-5的特点，然而目前如何使这些高浓度有机废水得到降解便成为制约柠檬酸行业高速前进的瓶颈。

现有技术中将柠檬酸废水经过离子交换和活性炭吸附等预处理技术处理后能够作为工艺用水重新回用，并且不会对柠檬酸发酵造成影响，然而，离子交换和活性炭吸附等预处理技术的成本都比较高，并且再生过程中会产生大量的二次废水；另外，对柠檬酸废水进行调ph处理需要消耗大量的无机试剂，同样不适于工业化的大规模运用，因此目前尚未得出一种有效处理柠檬酸废水的方法。

本发明考虑到在申请号为cn105886556a的发明专利中，发酵生产后剩余的残渣和废水中含有大量的黑曲霉菌体、硫酸钙渣及有机物，因此本发明通过对有机废弃物(废液和废渣)进行程序化处理后，使有机废弃物“变废为宝”并实现资源化利用，同时实现了有机废水的回收利用，具有较高的经济效益、生态效益和社会效益，是实现农业可持续发展的有力保障。

技术实现要素：

为了克服现有技术的缺点，本发明提供使用秸秆生产柠檬酸的废弃物制备牛蒡生物有机肥的方法，本发明以水稻秸秆发酵生产柠檬酸产生的废渣和废液为原料进行生物有机肥发酵研究，通过对固氮菌、解磷菌、解钾菌和生防菌的驯化及活化，采用高密度发酵，控制发酵条件，最后生产出牛蒡生物有机肥，本发明制备的牛蒡生物有机肥能够改善牛蒡的种植条件，降低生产成本，增加牛蒡的产量，提高牛蒡的品质。

为了达到上述目的，本发明采取的技术方案为：

使用秸秆生产柠檬酸的废弃物制备牛蒡生物有机肥的方法，包括如下步骤：

(1)原材料处理：将秸秆生产柠檬酸产生的废水和废渣的混合物进行灭菌处理；

(2)菌种活化：将解磷菌菌种、解钾菌菌种、固氮菌菌种及生防菌菌种分别经活化处理后得到解磷菌活化菌种子液、解钾菌活化菌种子液、固氮菌活化菌种子液及生防菌活化菌种子液；

(3)菌种驯化：将步骤(2)得到的固氮菌活化菌种子液、解磷菌活化菌种子液、解钾菌活化菌种子液和生防菌活化菌种子液分别进行驯化，得到能够承受步骤(1)得到的混合物的酸性环境的固氮菌驯化菌悬液、解磷菌驯化菌悬液、解钾菌驯化菌悬液及生防菌驯化菌悬液；

(4)高密度发酵：将步骤(3)制备得到的各菌驯化菌悬液共同接入至驯化菌高密度发酵培养基中进行发酵培养，5-8天后终止发酵，得到混合菌种；

(5)牛蒡生物有机肥的发酵：将步骤(1)的混合物与碳源混合均匀，得到发酵基质，然后接种步骤(4)发酵得到的混合菌种，并在25-35℃下通入0.5-1.0vvm无菌空气，搅拌发酵24-36小时，得牛蒡生物有机肥肥料；

其中，碳源为葡萄糖、淀粉及蔗糖中的一种，碳源与混合物的质量比为3-5：100。

优选的，所述步骤(4)中驯化菌高密度发酵培养基由以下质量百分比的原料组成：胰蛋白胨，12.5％；淀粉，5％；酵母膏，0.8％；葡萄糖，7％；乙酸钠，0.2％；磷酸二氢钾，0.1％；硫酸镁，0.02％；生物素，0.05％，余量为水。

优选的，所述步骤(2)中固氮菌活化所用固氮菌培养基由以下质量份数的原料组成：kh2po4，0.2份；k2hpo4，0.8份；mgso4·7h2o，0.2份；caso4·2h2o，0.1份；na2moo4·2h2o，0.05份；酵母膏，0.5份；甘露醇，20份；fecl3，0.02份；蒸馏水，1000份。

优选的，所述步骤(3)中固氮菌的驯化过程为：

在第一固氮菌培养液接种活化后的固氮菌种子液，在20-35℃下培养1-2天；再将在第一固氮菌培养液中培养后的固氮菌接种到第二固氮菌培养液中，在20-35℃下培养1-2天；最后将在第二固氮菌培养液中培养后的固氮菌接种到秸秆生产柠檬酸后的废水中，于20-35℃下培养1-2天，得到驯化固氮菌；并将所得的驯化固氮菌在无菌条件下离心、洗涤，菌体沉淀与水混合得到固氮菌驯化菌悬液；

所述第一固氮菌培养液由废水与固氮菌培养基按照4:6的体积比混合得到；所述第二固氮菌培养液由废水与固氮菌培养基按照7:3的体积比混合得到。

优选的，所述步骤(3)中解磷菌的驯化过程为：

在第一解磷菌培养液接种活化后的解磷菌种子液，在20-35℃下培养2天，第一天分为2个周期，每12个小时为一个周期，在每个周期内先厌氧4h，后提供无菌空气8h，第二天无菌空气24h；再将在第一解磷菌培养液中培养后的解磷菌接种到第二解磷菌培养液，在20-35℃下培养2天，第一天分为2个周期，每12个小时为一个周期，在每个周期内先厌氧6h，后提供无菌空气6h，第二天无菌空气24h；最后将在第二解磷菌培养液中培养后的解磷菌接种到秸秆生产柠檬酸后的废水中，于20-35℃下无菌空气中培养1-2天，得到驯化解磷菌；并将所得的驯化解磷菌在无菌条件下离心、洗涤，菌体沉淀与水混合得到解磷菌驯化菌悬液；

所述第一解磷菌培养液由废水与lb培养基按照4:6的体积比混合得到；所述第二解磷菌培养液由废水与lb培养基按照7:3的体积比混合得到。

所述步骤(3)中解钾菌的驯化过程与解磷菌的驯化过程相同。

优选的，所述步骤(3)中生防菌的驯化过程为：

在第一生防菌培养液接种活化后的生防菌种子液，常温下通无菌空气好氧培养1-3天；再将在第一生防菌培养液中培养后的生防菌接种到第二生防菌培养液，常温下通无菌空气好氧培养1-3天；最后将在第二生防菌培养液中培养后的生防菌接种到秸秆生产柠檬酸后的废水中，常温下通无菌空气好氧培养1-3天，得到驯化生防菌；并将所得的驯化生防菌在无菌条件下离心、洗涤，菌体沉淀与水混合得到生防菌驯化菌悬液；

所述第一生防菌培养液由废水与pd培养基按照4:6的体积比混合得到；所述第二生防菌培养液由废水与pd培养基按照7:3的体积比混合得到。

优选的，所述步骤(1)中的灭菌处理采用高温灭菌处理的方法，条件为100-120℃灭菌5-10min。

优选的，所述步骤(3)的废水为先经过孔径为0.5-1mm的滤网进行过滤后滤液。

优选的，所述步骤(4)的发酵条件为：在无菌空气中，30-35℃下在120-200r/min发酵罐内培养发酵。

与现有技术相比，本发明具有的有益效果是：

1、本发明通过原材料处理、菌种活化、菌种驯化、高密度发酵及牛蒡生物有机肥的发酵的过程制备得到了牛蒡生物有机肥，在有机肥的制备过程中，先在原材料处理过程进行高温瞬时灭菌，将秸秆生产柠檬酸后的废水和废渣中的杂菌进行灭杀，避免杂菌对即将接入的固氮菌、解磷菌、解钾菌和生防菌造成影响，然后在菌种活化过程中将保藏状态的菌种放入适宜的培养基中培养，并逐级扩大培养得到纯而壮的培养物，即获得活力旺盛的、接种数量足够的培养物，再将解磷菌活化菌种、解钾菌活化菌种、固氮菌活化菌种及生防菌活化菌种分别进行不同条件的驯化，使固氮菌、解磷菌、解钾菌和生防菌均能够在废水的酸性环境中生长并发挥作用，得到了耐酸性优异的固氮菌驯化菌悬液、解磷菌驯化菌悬液、解钾菌驯化菌悬液及生防菌驯化菌悬液，然后将驯化菌悬液进行高密度发酵，得到了足够用于发酵的菌种，且高密度发酵不仅减少培养容器的体积、培养基的消耗和提高下游工程中分离、提取的效率，而且还缩短了生产周期、减少设备投入和降低生产成本，从而提高了产物的比生产速率，最后将高密度发酵后的菌种与秸秆生产柠檬酸后的废水和废渣一起发酵，最终制备得到了牛蒡生物有机肥。

2、本发明制备的牛蒡生物有机肥为酸性、水性肥料，不仅能够中和因长期施用化学肥料而产生的碱性土壤，而且在施肥的同时有机肥中的水分缓解了土壤板结，且有机肥中含有的有机物质促进了植物的生长发育，因此本发明制备的牛蒡生物有机肥提供了能够改善牛蒡的种植条件，增加了牛蒡的产量，提高牛蒡的品质。

3、本发明采用秸秆生产柠檬酸后的废水和废渣为肥料的主要物质，不仅解决了秸秆生产柠檬酸后的废水处理难题，而且使有机废弃物“变废为宝”，并实现资源化利用，在生产上大大降低了生产的成本，同时实现了有机废水的回收利用，具有较高的经济效益、生态效益和社会效益，是实现农业可持续发展的有力保障。

具体实施方式

本发明的生防菌、固氮菌、解磷菌和解钾菌分别选自：

本发明中的固氮菌为圆褐固氮菌，解磷菌为酿酒酵母菌或巨大芽孢杆菌，解钾菌为胶质芽孢杆菌；圆褐固氮菌、酿酒酵母菌、巨大芽孢杆菌和胶质芽孢杆菌的试管菌种单独保存于温度为3-6℃的菌种保藏柜中，本发明使用的解磷菌、解钾菌及固氮菌均与申请号为“201610372100.6”，申请日为“2016.05.31”，名称为“一种利用固氮菌、解磷菌和解钾菌共同发酵制备生物有机肥的方法”中的固氮菌、解磷菌和解钾菌相同。

本发明的废水和废渣均来自于申请号为“cn105886556a”，申请日为“2016.08.24”，名称为“一种混菌发酵农作物秸秆生产柠檬酸的方法”的发明专利。

本发明中的生防菌种为绿色木霉(trichodermaviride)、哈茨木霉(trichodermaharziamum)、黄绿木霉(trichodermaauxeoviride)及康氏木霉(trichodermakoningii)；本发明使用的生防菌与申请号为“201010612049.4”，申请日为“2010.12.20”，名称为“利用甘薯淀粉废水和蘑菇渣生产木霉生防剂”中的生防菌相同。

实施例1

使用秸秆生产柠檬酸的废弃物制备牛蒡生物有机肥的方法，包括如下步骤：

(1)原材料处理：将秸秆生产柠檬酸后的废水和废渣的混合物于100℃下加热10min，进行灭菌处理；

(2)菌种活化：将解磷菌、解钾菌中的菌株分别接种在lb的斜面培养基上，将固氮菌接种在固氮菌培养基上，将生防菌接种在pd培养基上，均于28℃培养箱活化培养30h，分别得到解磷菌活化菌种子液、解钾菌活化菌种子液、固氮菌活化菌种子液及生防菌活化菌种子液；

其中，固氮菌培养基由以下质量份数的原料组成：kh2po4，0.2份；k2hpo4，0.8份；mgso4·7h2o，0.2份；caso4·2h2o，0.1份；na2moo4·2h2o，0.05份；酵母膏，0.5份；甘露醇，20份；fecl3，0.02份；蒸馏水，1000份；

其中，pd培养基为生化实验的常规培养基，由土豆、葡萄糖和水制成；

其中，lb的斜面培养基由以下质量份数的原料组成：酵母提取物，5份；蛋白胨，10份；nacl，5份；水，1000份，通过hcl和naoh调节ph7.4；

(3)菌种驯化：将固氮菌活化菌子液、解磷菌活化菌种子液、解钾菌活化菌种子液和生防菌活化菌种子液分别进行驯化，使各菌种子液能够承受秸秆生产柠檬酸后废水的酸性环境，分别得到固氮菌驯化菌悬液、解磷菌驯化菌悬液、解钾菌驯化菌悬液及生防菌驯化菌悬液；

驯化中的废液先经过孔径为0.5mm的滤网进行过滤，并使用过滤后的废水进行驯化；

a、所述固氮菌的驯化过程为：

配制废水体积占40％、固氮菌培养基体积占60％的第一固氮菌培养液，并在第一固氮菌培养液上接种活化后的固氮菌种子液，接种量为体积分数5％，在20℃下培养2天，进行下一步操作；

配制废水体积占70％、固氮菌培养基体积占30％的第二固氮菌培养液，并在第二固氮菌培养液接种上一步骤培养的固氮菌，接种量为体积分数5％，在20℃下培养2天，进行下一步操作；

在废水中加入上一步骤培养的固氮菌，接种量为体积分数5％，在20℃下培养2天，进行下一步操作；

将所得酵母培养液在无菌条件下1000r/min离心10min，倾去上清液，用无菌生理盐水洗涤菌体，再离心得湿菌体，加入无菌水制成浓度为10⁵个/ml的固氮菌驯化菌悬液；

b、所述解磷菌的驯化过程为：

配制废水体积占40％、lb培养基体积占为60％的第一解磷菌培养液，并在第一解磷菌培养液上接种活化后的解磷菌种子液，接种量为体积分数5％，在20℃下培养2天，第一天分为2个周期，在每12小时内，先厌氧4h，后提供无菌空气8h，第二天无菌空气24h，进行下一步操作；

配制废水体积占70％、lb培养基体积占为30％的第二解磷菌培养液，并在第二解磷菌培养液接种上一步骤培养的解磷菌，接种量为体积分数5％，在20℃下培养2天，第一天分为2个周期，在每12小时内，先厌氧6h，后提供无菌空气6h，第二天无菌空气24h，进行下一步操作；

在废水中加入上一步骤培养的解磷菌，接种量为体积分数5％，在20℃下无菌空气培养2天，进行下一步操作；

将所得酵母培养液在无菌条件下1000r/min离心10min，倾去上清液，用无菌生理盐水洗涤菌体，再离心得湿菌体，加入无菌水制成浓度为10⁶个/ml的解磷菌驯化菌悬液；

c、所述解磷菌的驯化过程为：

解钾菌的驯化过程与解磷菌的驯化过程一样，不同之处仅在于将解钾菌替换为解磷菌，制成浓度为10⁶个/ml的解钾菌驯化菌悬液；

d、所述生防菌的驯化过程为：

配制废水体积占40％、pd培养基体积占为60％的第一生防菌培养液，并在第一生防菌培养液上接种活化后的生防菌种子液，接种量为体积分数5％，通无菌空气好氧培养1天；

配制废水体积占70％、pd培养基体积占为30％的第二生防菌培养液，并在第二生防菌培养液接种上一步骤培养的生防菌，接种量为体积分数5％，通无菌空气好氧培养1天；

直接取秸秆生产柠檬酸的废水，并在废水中接种上一步骤培养的生防菌，接种量为体积分数5％，通无菌空气好氧培养1天，得到驯化生防菌；

将所得驯化生防菌在无菌条件下在1000r/min下离心10min，倾去上清液，用无菌生理盐水洗涤菌体，再在1000r/min的速率下离心3min，得湿生防菌体，然后加入无菌水制成浓度为10⁷个/ml的生防菌驯化菌悬液。

(4)高密度发酵：将步骤(3)制备得到的各菌种驯化菌悬液共同接入至驯化菌高密度发酵培养基中，在无菌空气中，25℃下在200r/min发酵罐内培养发酵，发酵培养8天，终止发酵，得到混合菌种；

所述驯化菌高密度发酵培养基质量百分比为：胰蛋白胨，12.5％；淀粉，5％；酵母膏，0.8％；葡萄糖，7％；乙酸钠，0.2％；磷酸二氢钾，0.1％；硫酸镁，0.02％；生物素，0.05％，余量为水；

(5)牛蒡生物有机肥的发酵：在50kg秸秆生产柠檬酸后的废水和废渣的混合物中加入1.5kg葡萄糖并混合均匀，然后接种步骤(4)发酵得到的混合菌种，接种量为5ml/100g发酵基质，然后在发酵条件为25℃，通入无菌空气的量为0.5vvm，搅拌36小时后，得牛蒡生物有机肥肥料。

实施例2

使用秸秆生产柠檬酸的废弃物制备牛蒡生物有机肥的方法，包括如下步骤：

(1)原材料处理：将秸秆生产柠檬酸后的废水和废渣的混合物于110℃下加热8min，进行灭菌处理；

(2)菌种活化：将解磷菌、解钾菌中的菌株分别接种在lb的斜面培养基上，将固氮菌接种在固氮菌培养基上，将生防菌接种在pd培养基上，均于30℃培养箱活化培养26h，分别得到解磷菌活化菌种子液、解钾菌活化菌种子液、固氮菌活化菌种子液及生防菌活化菌种子液；

其中，固氮菌培养基由以下质量份数的原料组成：kh2po4，0.2份；k2hpo4，0.8份；mgso4·7h2o，0.2份；caso4·2h2o，0.1份；na2moo4·2h2o，0.05份；酵母膏，0.5份；甘露醇，20份；fecl3，0.02份；蒸馏水，1000份；

其中，pd培养基为生化实验的常规培养基，由土豆、葡萄糖和水制成；

其中，lb的斜面培养基由以下质量份数的原料组成：酵母提取物，5份；蛋白胨，10份；nacl，5份；水，1000份，通过hcl和naoh调节ph7.5；

(3)菌种驯化：将固氮菌活化菌子液、解磷菌活化菌种子液、解钾菌活化菌种子液和生防菌活化菌种子液分别进行驯化，使各菌能够承受秸秆生产柠檬酸后废水的酸性环境，分别得到固氮菌驯化菌悬液、解磷菌驯化菌悬液、解钾菌驯化菌悬液及生防菌驯化菌悬液；

驯化中的废液先经过孔径为0.8mm的滤网进行过滤，并使用过滤后的废水进行驯化；

a、所述固氮菌的驯化过程为：

配制废水体积占40％、固氮菌培养基体积占60％的第一固氮菌培养液，并在第一固氮菌培养液上接种活化后的固氮菌种子液，接种量为体积分数15％，在30℃下培养2天，进行下一步操作；

配制废水体积占70％、固氮菌培养基体积占30％的第二固氮菌培养液，并在第二固氮菌培养液接种上一步骤培养的固氮菌，接种量为体积分数15％，在20℃下培养2天，进行下一步操作；

在废水中加入上一步骤培养的固氮菌，接种量为体积分数10％，在20℃下培养2天，进行下一步操作；

将所得酵母培养液在无菌条件下1000r/min离心10min，倾去上清液，用无菌生理盐水洗涤菌体，再离心得湿菌体，加入无菌水制成浓度为10⁵个/ml的固氮菌驯化菌悬液；

b、所述解磷菌的驯化过程为：

配制废水体积占40％、lb培养基体积占为60％的第一解磷菌培养液，并在第一解磷菌培养液上接种活化后的解磷菌种子液，接种量为体积分数15％，在20℃下培养2天，第一天分为2个周期，在每12小时内，先厌氧4h，后提供无菌空气8h，第二天无菌空气24h，进行下一步操作；

配制废水体积占70％、lb培养基体积占为30％的第二解磷菌培养液，并在第二解磷菌培养液接种上一步骤培养的解磷菌，接种量为体积分数15％，在20℃下培养2天，第一天分为2个周期，在每12小时内，先厌氧6h，后提供无菌空气6h，第二天无菌空气24h，进行下一步操作；

在废水中加入上一步骤培养的解磷菌，接种量为体积分数10％，在20℃下无菌空气培养2天，进行下一步操作；

将所得酵母培养液在无菌条件下1000r/min离心10min，倾去上清液，用无菌生理盐水洗涤菌体，再离心得湿菌体，加入无菌水制成浓度为10⁶个/ml的解磷菌驯化菌悬液；

c、所述解磷菌的驯化过程为：

解钾菌的驯化过程与解磷菌的驯化过程一样，不同之处仅在于将解钾菌替换为解磷菌，制成浓度为10⁶个/ml的解钾菌驯化菌悬液；

d、所述生防菌的驯化过程为：

配制废水体积占40％、pd培养基体积占为60％的第一生防菌培养液，并在第一生防菌培养液上接种活化后的生防菌种子液，接种量为体积分数15％，通无菌空气好氧培养1天；

配制废水体积占70％、pd培养基体积占为30％的第二生防菌培养液，并在第二生防菌培养液接种上一步骤培养的生防菌，接种量为体积分数15％，通无菌空气好氧培养1天；

直接取秸秆生产柠檬酸的废水，并在废水中接种上一步骤培养的生防菌，接种量为体积分数10％，通无菌空气好氧培养1天，得到驯化生防菌；

将所得驯化生防菌在无菌条件下在1000r/min下离心10min，倾去上清液，用无菌生理盐水洗涤菌体，再在1000r/min的速率下离心3min，得湿生防菌体，然后加入无菌水制成浓度为10⁷个/ml的生防菌驯化菌悬液。

(4)高密度发酵：将步骤(3)制备得到的各菌种驯化菌悬液共同接入至驯化菌高密度发酵培养基中，在无菌空气中，25℃下在150r/min发酵罐内培养发酵，发酵培养8天，终止发酵，得到混合菌种；

所述驯化菌高密度发酵培养基质量百分比为：胰蛋白胨，12.5％；淀粉，5％；酵母膏，0.8％；葡萄糖，7％；乙酸钠，0.2％；磷酸二氢钾，0.1％；硫酸镁，0.02％；生物素，0.05％；余量为水；

(5)牛蒡生物有机肥的发酵：在50kg秸秆生产柠檬酸后的废水和废渣的混合物中加入2kg淀粉并混合均匀，然后接种步骤(4)发酵得到的混合菌种，接种量为15ml/100g发酵基质，然后在发酵条件为25℃，通入无菌空气的量为0.5vvm，搅拌36小时后，得牛蒡生物有机肥肥料。

实施例3

使用秸秆生产柠檬酸的废弃物制备牛蒡生物有机肥的方法，包括如下步骤：

(1)原材料处理：将秸秆生产柠檬酸后的废水和废渣的混合物于120℃下加热5min，进行灭菌处理；

(2)菌种活化：将解磷菌、解钾菌中的菌株分别接种在lb的斜面培养基上，将固氮菌接种在固氮菌培养基上，将生防菌接种在pd培养基上，均于32℃培养箱活化培养24h，分别得到解磷菌活化菌种子液、解钾菌活化菌种子液、固氮菌活化菌种子液及生防菌活化菌种子液；

其中，固氮菌培养基由以下质量份数的原料组成：kh2po4，0.2份；k2hpo4，0.8份；mgso4·7h2o，0.2份；caso4·2h2o，0.1份；na2moo4·2h2o，0.05份；酵母膏，0.5份；甘露醇，20份；fecl3，0.02份；蒸馏水，1000份；；

其中，pd培养基为生化实验的常规培养基，由土豆、葡萄糖和水制成；

其中，lb的斜面培养基由以下质量份数的原料组成：酵母提取物，5份；蛋白胨，10份；nacl，5份；水，1000份，通过hcl和naoh调节ph7.6；

(3)菌种驯化：将固氮菌活化菌种子液、解磷菌活化菌种子液、解钾菌活化菌种子液和生防菌活化菌种子液分别进行驯化，使各菌能够承受秸秆生产柠檬酸后废水的酸性环境，分别得到固氮菌驯化菌悬液、解磷菌驯化菌悬液、解钾菌驯化菌悬液及生防菌驯化菌悬液；

驯化中的废液先经过孔径为1mm的滤网进行过滤，并使用过滤后的废水进行驯化；

a、所述固氮菌的驯化过程为：

配制废水体积占40％、固氮菌培养基体积占60％的第一固氮菌培养液，并在第一固氮菌培养液上接种活化后的固氮菌种子液，接种量为体积分数20％，在20℃下培养2天，进行下一步操作；

配制废水体积占70％、固氮菌培养基体积占30％的第二固氮菌培养液，并在第二固氮菌培养液接种上一步骤培养的固氮菌，接种量为体积分数20％，在20℃下培养2天，进行下一步操作；

在废水中加入上一步骤培养的固氮菌，接种量为体积分数15％，在20℃下培养2天，进行下一步操作；

将所得酵母培养液在无菌条件下1000r/min离心10min，倾去上清液，用无菌生理盐水洗涤菌体，再离心得湿菌体，加入无菌水制成浓度为10⁵个/ml的固氮菌驯化菌悬液；

b、所述解磷菌的驯化过程为：

配制废水体积占40％、lb培养基体积占为60％的第一解磷菌培养液，并在第一解磷菌培养液上接种活化后的解磷菌种子液，接种量为体积分数20％，在20℃下培养2天，第一天分为2个周期，在每12小时内，先厌氧4h，后提供无菌空气8h，第二天无菌空气24h，进行下一步操作；

配制废水体积占70％、lb培养基体积占为30％的第二解磷菌培养液，并在第二解磷菌培养液接种上一步骤培养的解磷菌，接种量为体积分数20％，在20℃下培养2天，第一天分为2个周期，在每12小时内，先厌氧6h，后提供无菌空气6h，第二天无菌空气24h，进行下一步操作；

在废水中加入上一步骤培养的解磷菌，接种量为体积分数15％，在20℃下无菌空气培养2天，进行下一步操作；

将所得酵母培养液在无菌条件下1000r/min离心10min，倾去上清液，用无菌生理盐水洗涤菌体，再离心得湿菌体，加入无菌水制成浓度为10⁶个/ml的解磷菌驯化菌悬液；

c、所述解磷菌的驯化过程为：

解钾菌的驯化过程与解磷菌的驯化过程一样，不同之处仅在于将解钾菌替换为解磷菌，制成浓度为10⁶个/ml的解钾菌驯化菌悬液；

d、所述生防菌的驯化过程为：

配制废水体积占40％、pd培养基体积占为60％的第一生防菌培养液，并在第一生防菌培养液上接种活化后的生防菌种子液，接种量为体积分数20％，通无菌空气好氧培养1天；

配制废水体积占70％、pd培养基体积占为30％的第二生防菌培养液，并在第二生防菌培养液接种上一步骤培养的生防菌，接种量为体积分数20％，通无菌空气好氧培养1天；

直接取秸秆生产柠檬酸的废水，并在废水中接种上一步骤培养的生防菌，接种量为体积分数15％，通无菌空气好氧培养1天，得到驯化生防菌；

将所得驯化生防菌在无菌条件下在1000r/min下离心10min，倾去上清液，用无菌生理盐水洗涤菌体，再在1000r/min的速率下离心3min，得湿生防菌体，然后加入无菌水制成浓度为10⁷个/ml的生防菌驯化菌悬液。

(4)高密度发酵：将步骤(3)制备得到的各菌种驯化菌悬液共同接入至驯化菌高密度发酵培养基中，在无菌空气中，25℃下在120r/min发酵罐内培养发酵，发酵培养5天，终止发酵，得到混合菌种；

所述驯化菌高密度发酵培养基质量百分比为：胰蛋白胨，12.5％；淀粉，5％；酵母膏，0.8％；葡萄糖，7％；乙酸钠，0.2％；磷酸二氢钾，0.1％；硫酸镁，0.02％；生物素，0.05％；余量为水；

(5)牛蒡生物有机肥的发酵：在50kg秸秆生产柠檬酸后的废水和废渣的混合物中加入2.5kg蔗糖并混合均匀，然后接种步骤(4)发酵得到的混合菌种，接种量为20ml/100g发酵基质，然后在发酵条件为25℃，通入无菌空气的量为0.5vvm，搅拌36小时后，得牛蒡生物有机肥肥料。

本发明实施例1-实施例3制备得到的牛蒡生物有机肥肥料均能够缓解了土壤板结的现象，而且能够有效促进植物的生长发育，因此本发明选用实施例2为例来进行深入研究。

对比例1

与实施例2的制备过程相同，不同之处仅在于，不含有步骤(3)的驯化过程。

对比例2

与实施例2的制备过程相同，不同之处仅在于，不含有步骤(2)的活化过程。

对比例3

与实施例2的制备过程相同，不同之处仅在于，在步骤(5)牛蒡生物有机肥的发酵的过程中不添加碳源。

对比例4

在河北丰农有机肥制造有限公司购买的牛蒡生物有机肥。

对比试验：

设置5个实验组和一个空白对照组，5个实验组包括实施例2及对比例1-4的肥料，且分别用5个实验组的肥料对牛蒡进行施肥，空白对照组在牛蒡的种植过程中不施加肥料；

具体方法为：

选择沛县、丰县交界处的经过多年施肥后的土壤，牛蒡均于3月底进行整地、挖沟，挖到适应牛蒡种植的标准后，将生物有机肥分层均匀施于沟内，在沟的上面起垄，4月上旬进行播种，施用量每亩3000kg，收获前不做追肥，病虫害按照常规管理，并在8月底之前进行观察并记录牛蒡的生长情况，结果如表1所示：

表15个实验组和一个空白对照组的牛蒡生长状况表

由表1可以看出，实施例2的茎粗、直根长度、成熟期和单株重均是最优异的，且实施例2和对比例4的牛蒡生长状况相似，说明本发明制备得到的生物有机肥可媲美并略优于现有技术的生物有机肥料，可用于牛蒡的种植和生产；空白对照组与对比例1相比，对比例1的茎粗、直根长度、成熟期和单株重略优于空白对照组，说明秸秆生产柠檬酸的废弃物中的有机物对牛蒡的生长具有促进作用，对比例1与实施例2相比，茎粗、直根长度、成熟期和单株重均差异明显，说明对比例1中由于菌种均未得到驯化，难以在秸秆生产柠檬酸的废弃物中进行生长，因此菌种无法在土壤中发挥作用；实施例2的茎粗、直根长度、成熟期和单株重均优于对比例2及对比例3的肥料，说明菌种的活化且在发酵的过程中添加碳源均有利于生物有机肥的发酵；综上所述，本发明制备得到了适应于牛蒡生长发育的生物有机肥。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。