一种高效微藻叶面肥的制备方法及使用方法与流程

本发明属于海藻肥的技术领域，特别涉及一种高效微藻叶面肥的制备方法及使用方法。

背景技术：

叶面施肥技术与叶面肥的应用是人们认识植物叶面营养吸收规律的重大突破，叶面施肥打破了土壤根部施肥的传统方式，作为对作物土壤施肥的一种直接、高效的辅助措施，已成为现代农业生产中一项重要的施肥技术。但叶面对养分的吸收受叶片结构、生长环境及喷施液理化性质等多种因素的影响，从而影响叶面施肥效果。

叶面气孔控制着植物与外界环境的气体交换，其孔径大小会随着环境因子的变化而变化，而这种变化对植物光合作用和蒸腾作用的影响是不同的。绿色植物的正常生长都离不开光合作用，提高光合作用和减少蒸腾作用能有效的提高植物生长效率，提高植物有机物质的积累量，从而使植物具有更好更高的经济价值。

小球藻（chlorella）为绿藻门小球藻属普生性单细胞绿藻，是一种球形单细胞淡水藻类，直径3~8微米，是地球上最早的生命之一，出现在20多亿年前，是一种高效的光合植物，以光合自养生长繁殖，分布极广。小球藻广泛分布于自然界，以淡水水域种类最多；易于培养，不仅能利用光能自养，还能在异养条件下利用有机碳源进行生长、繁殖；并且生长繁殖速度快，是地球上动植物中唯一能在20h增长4倍的生物，所以其应用价值很高。最新研究发现，以小球藻和小球藻提取物制备而成的叶面肥是一种很好的二氧化碳捕集剂，它即可在设施栽培条件下使用，也可以在大田栽培过程中使用，不仅适用范围比较广泛，而且用起来也比较便捷。通过叶面施肥使小球藻通过气孔进入植物叶面，利用小球藻的高效光合作用对二氧化碳的捕集作用，提高植物叶面的光合作用的能力，进而增强长势、提高产量和品质。

发明专利cn201010546192.8一种利用益生菌和微藻产生微态叶面肥的方法，首先分别培养获得细胞浓度达到100亿/ml以上的芽孢杆菌、乳酸菌、沼泽红假单胞菌、及细胞浓度20亿/ml以上的酵母菌和小球藻的液体培养物，然后将制得的4种益生菌和1种小球藻液体培养物按照各占一定的体积比例进行混合，即可获得总细胞浓度达到50亿/ml以上的液体微生态叶面肥。该发明的优点是：所用菌种和小球藻均系人类可以食用的益生菌，安全无毒；微生态叶面肥集益生菌和小球藻及其代谢产物促进植物生长的优势集合在一起；每隔10天将微生态叶面肥用水稀释100倍喷洒于植物叶面上，60天时间内提高植物产量达到30％以上。在提高粮食等作物的产量和品质方面具有重要的应用价值。

发明专利cn201410626402.2以藻类加工废弃物生产有机海藻肥料的方法及制成的肥料，该方法主要包括：藻类废弃物粉碎混匀，酶解分解藻类细胞壁、多糖及蛋白质，固液分离酶解液，再用乙醇浸提酶解藻渣制成浸膏，酶解液和浸膏混合形成有机海藻液肥，掺入一定比例的藻渣后可形成有机海藻颗粒肥，当加入适量的化学肥料后可制成有机海藻复合型肥。该发明以大型海藻加工和微藻加工过程产生的废物为原料制备海藻有机肥，不仅操作简便，制作周期短，而且为大型海藻或微藻加工企业提供处理废弃物的新思路，提高企业生产加工的环境友好性，提高了企业经济效益。

发明专利cn201210093253.9一种促进植物生长的微生物肥料及其培养方法，包括复合芽孢杆菌和培养基，其特征是：1)所述复合芽孢杆菌由枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和侧孢芽孢杆菌组成，三种芽孢杆菌在复合芽孢杆菌中的重量比例为枯草芽孢杆菌10~20％、地衣芽孢杆菌20~30％和侧孢芽孢杆菌50~70％；2)所述培养基由腐殖酸钠、麸皮、米糠、新鲜马尾藻和小球藻组成，或者所述培养基由腐殖酸钠、麸皮、米糠、新鲜马尾藻、小球藻和浓度为30亿/ml的光合细菌组成。本发明可将土壤中有机质高效分解为植物易吸收利用的无机盐；具有刺激植物根系发育、生长与结果的效果，相对于现有的微生物肥料具有松土保肥、改善土壤、增加肥力、促进生长、增强抗性、减少病害效果好的特点。

微藻肥技术是现代农业技术发展研究的重点技术之一，现有技术中，叶面肥已从单一功能施肥发展到多功能施肥、全面提高植物生长方向发展，但叶面肥受外部环境因素影响比其他肥料的大，存在营养流失快，叶面吸收效率低的问题，不能有效利用微藻的营养物质，同时气孔吸收会增加蒸腾作用，导致光合作用和蒸腾作用不平衡，不利于植物生长。

技术实现要素：

针对现有叶面肥存在营养物质利用率低，施用叶面肥后导致光合作用和蒸腾作用不平衡的缺陷，本发明提供一种高效持久微藻活菌叶面肥及其制作方法，通过发酵提取微藻的有机物质与活体微藻复配而成，具有成本低，原料来源广泛、性能稳定、肥效持久，能有效保持植物叶片在吸收营养物质时保持光合作用和蒸腾作用的平衡，促进植物生长，提高植物有机物的积累，改善植物有机物的品质的作用。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种高效微藻叶面肥，由以下重量百分比组分复配而成：50%~80%小球藻活菌液，1%~5%褐藻酸，6%~10%混合藻发酵液，余量为水。

具体制备步骤如下：

小球藻活菌液的制备：

（1）培养获得细胞浓度达2×10⁸个/ml以上的小球藻液体培养物；

（2）将小球藻液体培养物和功能化离子液体按照体积比（6~8）：（2~4）在25~30℃、0.1~0.5mpa下充分混合后放置12h，得到小球藻活菌液；

所述的功能化离子液体为氨基化离子液体、氟烷基化离子液体、氰基化离子液体中的一种；

混合藻发酵液的制备：

（1）按重量份数比，取海带粉10~20份，褐藻酸溶液20~30份，细胞浓度达1×10⁸个/ml以上的小球藻液体培养物50~60份进行混合得到混合液；

（2）于混合液中加入其质量2~3倍的basal液体培养基，接种0.1%~0.5%复合菌，在28~32℃、140~220r/min、2000~4000lux光照下连续发酵20~30h，即可得到混合藻发酵液；

所述复合菌含有以下菌类：黑曲霉、米曲霉和绿色木霉；

叶面肥的制备：

按重量百分比计，取上述小球藻活菌液40%~50%、混合藻发酵液6%~10%、褐藻酸1%~5%、硝酸钠1%~3%、海藻糖5%~8%、尿素1%~3%、5-氨基乙酰乙酸1%~3%，余量为水进行混合，即得高效微藻叶面肥。

以小球藻为支撑体，在小球藻表面固载功能化离子液体，混合小球藻和海带发酵提取物制备成离子液膜态的叶面肥，能提高二氧化碳捕集效率；功能化离子液体能对大气中的二氧化碳进行吸收富集，然后并传递到小球藻进行光合作用，同时混合藻发酵液中的褐藻酸能与离子液体形成一层液膜，使本发明的叶面肥在喷施到植物叶面后形成一层薄膜，增大了叶面肥和叶片的接触面，减少了营养的流失和植物叶面的蒸腾作用；

褐藻酸和海带发酵产物甜菜碱能提高植物的抗病能力，褐藻酸能使水溶性物质更容易地透过叶面气孔进入到叶面细胞中，使植物更高效的吸收微藻中的营养物质；甜菜碱能促进植物细胞叶绿素的合成，进一步提高了植物的光合作用，从而调节了植物叶面在吸收过程中由于气孔增大而增大的蒸腾作用和光合作用之间的平衡，使植物积累更多的有机物，促进生长。

作为本发明的进一步改进，所述的basal培养基含有以下浓度的物质：葡萄糖20~50g/l，nano31250~3750mg/l，kh2po41250mg/l，mgso4·7h2o1000mg/l，edta500mg/l，h3bo3114.2mg/l，cacl2·2h2o111mg/l，feso4·7h2o49.8mg/l，znso4·7h2o88.2mg/l，mncl2·4h2o14.2mg/l，na2moo4·2h2o11.92mg/l，cuso4·5h2o15.7mg/l，co(no3)2·6h2o4.9mg/l，ph为6.1。

作为本发明的进一步改进，所述复合菌由2×10⁷~5×10⁷个/ml孢子悬浮液的米曲霉、2×10⁷~5×10⁷个/ml孢子悬浮液的黑曲霉和1×10⁷~1.5×10⁷个/ml孢子悬浮液的绿色木霉按照体积比1:1:5混合而成。

单菌发酵所产的纤维素酶存在酶系不完整和个别酶活低的缺陷，如绿色木霉及其近缘菌株发酵产内切葡聚糖酶活力较高，但所产的纤维素酶中普遍存在β-葡萄糖苷酶（β-ga）活力低的缺陷，而黑曲霉产β-葡萄糖苷酶能力较高，产内切和外切葡聚糖酶能力较低，米曲霉发酵不仅能产蛋白酶和纤维素酶，同时产植酸酶以促进发酵液中菌的生长。通过复合菌发酵的互补能有效酶解小球藻细胞使藻内营养物质流出、大分子有机物降解为易吸收的小分子物质。米曲霉、黑曲霉和绿色木霉在繁殖过程中会产生孢子，影响微藻光合作用和叶绿体的光合作用能力，因此不宜浓度过大，但浓度过低的孢子量产生的酶活力低，无法完全降解快速生长的小球藻细胞，因此采用上诉孢子浓度的菌液作为混合菌发酵能最大程度促进藻细胞生长和降解藻细胞。

5-氨基乙酰乙酸是叶绿素合成的先导物，能提高活菌小球藻的光合作用能力，从而提高小球藻的二氧化碳捕集能力，提高光合作用。

海藻糖能降低叶绿素的降解，提高植物的抗逆性，保护植物光合作用器官，提高光合作用效率，从而使植物在气温最高时保持光合作用和蒸腾作用的平衡。

作为本发明的进一步改进，所述的氨基化离子液体为1-（3-氨基丙基）-3丁基咪唑四氟硼酸盐（[nh2p-bim]bf4）、1-氨丙基-3-甲基咪唑溴盐([apmim][br])中一种。

作为本发明的进一步改进，所述的氟烷基化离子液体为n-氨丙基-3-甲基咪唑三氟甲砜（[h2nc3h6mim][cf3so3]）、n-氨丙基-3-甲基咪唑双（三氟甲磺酰）亚胺（[h2nc3h6mim][tf2n]）中的一种。

作为本发明的进一步改进，所述的氰基化离子液体为1-丁基-三甲基咪唑二氰胺(［bmim］［n(cn)2］)、1-乙基-3甲基咪唑四氰硼酸盐（[emim][b（cn）4]）中一种。

功能化离子液体对二氧化碳的吸收能力优于常规离子液体，氨基化离子液体可以对二氧化碳进行吸收和传递，使二氧化碳进入小球藻细胞和叶片细胞中，提高植物的光合作用。氟烷基化离子液体具有复杂的氢键网状结构，能大面积的吸收二氧化碳，提高植物细胞的二氧化碳的捕集效率。氰基化离子液体的极性原子可以与二氧化碳中碳原子发生lewis酸碱作用，提高叶绿体对二氧化碳的利用率。

作为本发明的进一步改进，所述的硝酸钠浓度为40~50g/l。

硝酸钠浓度影响植物细胞叶绿素含量，在40~50g/l时大部分植物叶绿素含量能达到最高值。

作为本发明的进一步改进，本发明的叶面肥在施肥时，将叶面肥用水稀释100~200倍后，喷洒于植物叶面，植物叶面背面喷洒量多于叶面正面。

本发明的有益效果：

1、本发明制备的微藻叶面肥，结合小球藻的高效光合作用和氨基功能化离子液体液膜对二氧化碳的高效吸附和传递，使制备的叶面肥具有更高的二氧化碳捕集效率，从而提高植物光合作用；

2、本发明制备的微藻叶面肥能提高微藻和植物叶绿素的合成量，保护植物光合作用器官，从而能使植物在高温条件下保持光合作用和蒸腾作用的平衡；

3、本发明制备的微藻叶面肥，能在叶片表面形成一层膜，减少了肥力流失，同时褐藻酸能促进植物叶面对营养物质的吸收，表面呈膜还能减少蒸腾作用，使光合作用和蒸腾作用保持平衡，避免了积累有机物的流失，促进植物生长。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明,但不用来限制本发明的范围，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施例，都属于本发明所保护的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

一、小球藻活菌液的制备

实施例1

（1）培养获得细胞浓度达2×10⁸个/ml以上的小球藻液体培养物；

（2）将小球藻液体培养物和1-（3-氨基丙基）-3丁基咪唑四氟硼酸盐（[nh2p-bim]bf4）离子液体按照体积比6：4在25℃、0.1mpa下充分混合后放置12h，得到小球藻活菌液；

实施例2

（1）培养获得细胞浓度达2×10⁸个/ml以上的小球藻液体培养物；

（2）将小球藻液体培养物和n-氨丙基-3-甲基咪唑三氟甲砜（[h2nc3h6mim][cf3so3]）离子液体按照体积比8：2在28℃、0.5mpa下充分混合后放置12h，得到小球藻活菌液；

实施例3

（1）培养获得细胞浓度达2×10⁸个/ml以上的小球藻液体培养物；

（2）将小球藻液体培养物和1-丁基-三甲基咪唑二氰胺(［bmim］［n(cn)2］)离子液体按照体积比7：3在26℃、0.3mpa下充分混合后放置12h，得到小球藻活菌液；

二、混合澡发酵液的制备

实施例4

（1）按重量份数比，取海带粉20份，褐藻酸溶液30份，细胞浓度达1×10⁸个/ml以上的小球藻液体培养物50份进行混合得到混合液；

（2）于混合液中加入其质量2倍的basal液体培养基，接种0.1%复合菌，在28℃、140r/min、2000lux光照下连续发酵20h，即可得到混合藻发酵液；

所述复合菌由2×10⁷个/ml孢子悬浮液的米曲霉、2×10⁷个/ml孢子悬浮液的黑曲霉和1×10⁷个/ml孢子悬浮液的绿色木霉按照体积比1:1:5混合而成。

所述的basal培养基含有以下浓度的物质：葡萄糖20g/l，nano31250mg/l，kh2po41250mg/l，mgso4·7h2o1000mg/l，edta500mg/l，h3bo3114.2mg/l，cacl2·2h2o111mg/l，feso4·7h2o49.8mg/l，znso4·7h2o88.2mg/l，mncl2·4h2o14.2mg/l，na2moo4·2h2o11.92mg/l，cuso4·5h2o15.7mg/l，co(no3)2·6h2o4.9mg/l，ph为6.1。

实施例5

（1）按重量份数比，取海带粉20份，褐藻酸溶液30份，细胞浓度达1×10⁸个/ml以上的小球藻液体培养物50份进行混合得到混合液；

（2）于混合液中加入其质量3倍的basal液体培养基，接种0.5%复合菌，在32℃、220r/min、4000lux光照下连续发酵30h，即可得到混合藻发酵液；

所述复合菌由5×10⁷个/ml孢子悬浮液的米曲霉、5×10⁷个/ml孢子悬浮液的黑曲霉和1.5×10⁷个/ml孢子悬浮液的绿色木霉按照体积比1:1:5混合而成。

所述的basal培养基含有以下浓度的物质：葡萄糖50g/l，nano33750mg/l，kh2po41250mg/l，mgso4·7h2o1000mg/l，edta500mg/l，h3bo3114.2mg/l，cacl2·2h2o111mg/l，feso4·7h2o49.8mg/l，znso4·7h2o88.2mg/l，mncl2·4h2o14.2mg/l，na2moo4·2h2o11.92mg/l，cuso4·5h2o15.7mg/l，co(no3)2·6h2o4.9mg/l，ph为6.1。

实施例6

（1）按重量份数比，取海带粉18份，褐藻酸溶液25份，细胞浓度达1×10⁸个/ml以上的小球藻液体培养物57份进行混合得到混合液；

（2）于混合液中加入其质量3倍的basal液体培养基，接种0.4%复合菌，在30℃、200r/min、3500lux光照下连续发酵24h，即可得到混合藻发酵液；

所述复合菌由3×10⁷个/ml孢子悬浮液的米曲霉、3×10⁷个/ml孢子悬浮液的黑曲霉和1.2×10⁷个/ml孢子悬浮液的绿色木霉按照体积比1:1:5混合而成。

所述的basal培养基含有以下浓度的物质：葡萄糖35g/l，nano33000mg/l，kh2po41250mg/l，mgso4·7h2o1000mg/l，edta500mg/l，h3bo3114.2mg/l，cacl2·2h2o111mg/l，feso4·7h2o49.8mg/l，znso4·7h2o88.2mg/l，mncl2·4h2o14.2mg/l，na2moo4·2h2o11.92mg/l，cuso4·5h2o15.7mg/l，co(no3)2·6h2o4.9mg/l，ph为6.1。

三、微藻活菌叶面肥的复配与使用

实施例7

按重量百分数计，取实施例1小球藻活菌液50%、褐藻酸1%、实施例4混合藻发酵液10%、硝酸钠1%、海藻糖5%、尿素1%、5-氨基乙酰乙酸1%，余量为水混合制备成高效微藻叶面肥。

施用时，将叶面肥用水稀释100倍后，喷洒于植物叶面，植物叶面背面喷洒量多于叶面正面。

实施例8

按重量百分数计，取实施例2小球藻活菌液40%，褐藻酸5%，实施例5混合藻发酵液6%，硝酸钠3%、海藻糖8%、尿素3%、5-氨基乙酰乙酸3%，余量为水混合制备成高效微藻叶面肥。

施用时，将叶面肥用水稀释200倍后，喷洒于植物叶面，植物叶面背面喷洒量多于叶面正面。

实施例9

按重量百分数计，取实施例3小球藻活菌液63%，褐藻酸4%，实施例6混合藻发酵液8%，硝酸钠2%、海藻糖6%、尿素2%、5-氨基乙酰乙酸2%，余量为水混合制备成高效微藻叶面肥。

施用时，将叶面肥用水稀释150倍后，喷洒于植物叶面，植物叶面背面喷洒量多于叶面正面。

四、试验例

利用实施例9制备的微藻活菌叶面肥，在西红柿定植时按4公斤/亩的用量使用，与不施肥、施用固氮微生物菌剂和小球藻的西红柿作对比，计算每亩产量，结果如表1。

表1

由表1可知，单独使用本发明实施例9制备的微藻活菌叶面肥比不施肥的对照增产40.2%，比单独使用固氮微生物菌剂增产18.7%，比单独使用小球藻增产28.4%。

以上实施例仅为本发明的示例性实施例，不用于限制本发明，本发明的保护范围由权利要求书限定。本领域人员可以在本发明的实质和保护范围内，对本发明做出各种修改或等同替换，这种修改或等同替换也应视为落在本发明的保护范围内。