柱花草与炭疽菌互作的生理响应及苯丙氨酸解氨酶基因SqPAL1的功能研究

柱花草(Stylosanthes spp.)是我国南方热带与亚热带地区广泛种植的优质豆科牧草,由胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeogloeporioide)诱发的炭疽病(Anthracnose)是目前威胁柱花草生产的最主要病害,可造成柱花草的营养价值降低,严重减产,甚至绝收。研究柱花草接种炭疽菌后的生理响应,挖掘关键响应基因,具有重要科学意义和潜在应用价值。本研究以热研2号柱花草为材料,观察了胶孢炭疽菌对柱花草的侵染进程;分析炭疽菌侵染对柱花草后抗氧化酶系统和代谢产物的影响,通过RNA-seq分析鉴定了柱花草响应炭疽病的相关基因,克隆并鉴定苯丙氨酸解氨酶基因SgPAL1,并对其功能开展研究,主要的结果如下:1、柱花草叶片接种胶孢炭疽菌后,在36hpi(hourpostinoculated)出现明显的褪绿,60 hpi出现黑褐色坏死线;显微观察发现在36 hpi形成大量初生菌丝,48 hpi-60 hpi次生菌丝迅速生长,而后84 hpi宿主很快崩解死亡。次生菌丝的出现标志着柱花草炭疽菌从活体营养阶段到死体营养阶段的转变。2、利用二联基联苯胺(DAB)和氯化硝基四氮唑蓝(NBT)染色法,分析炭疽菌侵染对柱花草叶片活性氧物质H202和02-累积的影响,随着侵染时间的延长,叶片活性氧的累积逐渐增加,细胞受损加剧;接种炭疽菌后,柱花草叶片抗氧化相关的酶活性与代谢物含量均不同程度受到调控,其中过氧化氢酶(CAT)活性持续升高,超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)等活性以及抗坏血酸(AsA)、谷胱甘肽(GSH)的含量先升高后降低。表明抗氧化酶活性增加是柱花草对炭疽菌入侵的一种适应性响应,以应对活性氧积累。3、柱花草受到炭疽菌侵染后,苯丙烷类代谢途径下游的次生代谢产物(总酚、类黄酮、原花青素、花青素、单宁)含量均在特定阶段显著增加,在96 hpi原花青素和类黄酮含量分别是CK的14倍、2倍,总酚、花青素含量在24 hpi分别增加了 70.95%和75.61%;单宁含量在48 hpi增加了 69.09%。PAL活性在24hpi与48hpi显著升高,之后逐渐下降。以上结果表明PAL介导的苯丙烷类代谢参-与调控柱花草对炭疽病的抗性。4、通过RNA-seq分析柱花草叶片在接种炭疽菌后不同时间点(24、48、60、96 hpi)与CK的差异表达基因,共获得700,643,352条clean reads,194,879个转录本和112,754条完整的unigene。其中,60 hpi样品出现的差异表达基因数量最多,上调基因3831个,下调基因6596个。基因功能注释分析发现,差异表达基因主要富集在苯丙素生物合成、植病互作、植物激素信号传导等通路中。柱花草苯丙烷类代谢途径中3个关键酶的编码基因,即苯丙氨酸解氨酶(PAL)、肉桂酸-4-羟化酶(C4H)和4-香豆酸辅酶A连接酶(4CL),均有家族成员受炭疽菌侵染诱导增强表达。5、从柱花草转录组的Unigene数据库中克SgPALs家族的3个基因,分别命名为SgPAL1、SgPAL2、SgPAL3,碱基序列长度分别为2148bp、2076 bp、2136 bp,依次编码715、691、711个氨基酸,3条序列的一致性为80.51%;Real-time PCR的表达模式分析表明,3个SgPALs在根、茎和叶中均有表达,其中SgPAL1和SgPAL2在根中表达量最高,SgPAL3在茎秆中表达量最高;响应炭疽菌侵染的表达模式分析表明,SgPAL1、SgPAL2和SgPAL3分别从48hpi、60hpi和96hpi开始,表达量显著高于CK;拟南芥原生质体细胞的亚细胞定位分析表明,SgPAL1、SgPAL2和SgPAL3均定位于细胞质。6、通过农杆菌介导的柱花草遗传转化体系,进行SgPAL1的功能研究。构建超量表达SgPAL1的表达载体,获得SgPAL1转基因柱花草。To代阳性株系的PAL酶活、总酚、类黄酮和原花青素含量显著高于野生型;炭疽菌离体侵染实验发现超量表达SgPAL1转基因株系的病斑直径显著低于野生型。表明超量表达SgPAL1能显著增强柱花草对炭疽病的抗性。综上所述,本研究初步解析了SgPAL 介导的苯丙烷类代谢途径通过提高下游次生代谢产物(总酚、类黄酮和原花青素)含量来增强柱花草对炭疽病抗性的机制,研究结果将为柱花草抗病品种选育提供理论依据和候选基因资源。 ...