微流控技术是一项涉及多学科交叉的综合技术。它也被称为芯片实验室（LOC），可以将传统实验室的生物和化学实验集中在几平方厘米的高集成度芯片上。即时检测（POCT）作为一种快速、便携、即时的医学检验方法，在传染病检测、疾病筛查、疾病预防、术后治疗等领域具有重要意义。因此，微流控设备已成为POCT技术的主要实现平台。基于微流控技术的POCT设备结合了POCT和微流控的优点，有望在医学检验领域大放异彩。本文介绍了微流控技术与其他技术相结合的应用。
2020年初，新型冠状病毒（COVID-19）的爆发给人们的生命和健康造成了不可估量的损失，并损害了世界各地的经济。这场突如其来的灾难暴露了传统诊断方法的缺点。大多数传统的疾病检测方法虽然准确，但需要昂贵而复杂的仪器，由实验室的专业技术人员操作，并且复杂且耗时。在这种全球大流行的情况下，传统的检测方法似乎不适合快速诊断，因此迫切需要开发可用于快速筛查病毒的及时诊断，特别是在不发达和偏远的国家和地区，很难满足传统检测方法的上述严格实验条件。因此，开发和推广快速简便的传染病检测方法对于维护全球公共卫生具有重要意义。
即时检测（POCT）是一种快捷的医学检验方法。POCT具有即时，快速，简单，便携和自动化的优点，可以缩减实验室中复杂的样品处理时间，并且不受环境的限制。因此，近年来它已成为体外分子诊断领域的研究热点。POCT检测中常用的诊断技术主要包括免疫层析，胶体金，干化学和环介导的等温扩增（LAMP）。近年来，随着科学技术的进步，传感技术，先进制造技术和物联网的发展，微型，方便和集成的微流控芯片技术和生物传感器技术越来越多地应用于POCT检测，这在该领域具有明显的优势。
本篇文章主要集中在POCT医学检验领域的微流控，生物传感技术和LAMP技术的关键技术（图1）。
图1.微流控技术及其在POCT中的综合应用。
2 微流控技术
微流控技术是一种用于在微纳米尺度空间中精确控制和操纵微纳米流体的科学和技术。微流控芯片也称为芯片实验室（LOC），是用于实现微流控技术的技术平台和设备之一。微流控芯片可以将生物和化学实验中涉及的基本功能单元集成在几平方厘米的芯片上，例如样品制备，反应，分离和检测。流体通过微通道流向每个反应单元。微流控芯片的基本特征和优势是在微型平台上灵活组合和大规模集成多个技术单元，这是一门涉及物理，化学，材料科学，医学，力学，光学，机械工程，微机械加工和生物工程的跨学科。
3 微流控技术在POCT中的应用
3.1微流控芯片检测技术
微流控芯片的信号采集和检测装置是微流控功能部件的重要组成部分。为了在几平方厘米的微流控芯片上完成检测过程，毫无疑问，对检测方法和设备的要求更为严格，至少要满足小尺寸，高灵敏度和快速响应速度的特点。微流控芯片的检测技术包括激光诱导荧光检测，紫外吸收分光光度法检测，化学发光检测，电化学检测，质谱检测，等离子体发射光谱检测，热透镜光谱检测和生物传感器检测。光学检测和电化学检测是目前应用最广泛的检测方法。
激光诱导荧光检测是最早，使用最广泛，最灵敏的光学检测方法。原理是原子在特定频率的激发光源下吸收一定波长的光。原子从低能级转变为高能级，并释放出低频荧光。激光诱导荧光是一种通过使用激光作为激发光源诱导电子跃迁产生荧光的方法。Whitesides团队在2006年研发了一种使用荧光检测的PDMS芯片系统。
化学发光检测也是一种高灵敏度的检测方法。它通过使用发光现象检测发光强度来确定物质的含量，其中基态分子吸收能量以在化学反应过程中以光辐射的形式转变为激发态并返回基态。与光学检测相比，化学发光检测不需要光源，设备简单，易于小型化和集成，更适合微流控芯片检测。Lin的小组在2006年设计了一种用于多通道检测的旋转扫描化学发光检测装置。
电化学检测是一种将物质的化学信号转换为电信号进行分析和测试的检测方法。它具有灵敏度高、设备简单、成本低等优点。Mathies等人将其设计为使用鞘流技术和毛细管电泳来检测分析物。
3.2基于LAMP的微流控芯片
微流控技术与核酸诊断的结合是微流控技术最有前景的应用方向之一。该组合极大地简化了核酸扩增和检测的复杂步骤，消除了重型设备，因此非常适合POCT分子诊断。等温扩增技术的核酸扩增过程只需要在恒温下完成。它不需要复杂的加热和冷却温度系统，这大大缩短了反应时间，更适合于小型化仪器。因此，微流控技术和等温扩增技术的结合可以利用两者的优点，同时提高检测灵敏度和检测通量，这使其在分子POCT领域具有巨大的发展潜力。
Notomi等人在2000年提出的LAMP技术的原理是使用四种特异性引物和一条链代替活性DNA聚合酶在大约65℃下扩增核酸。微流控技术可以为LAMP提供灵活的结构平台，例如独立的反应微腔和用于样品转移的蛇形流动通道。这不仅加快了反应速度，节省了反应试剂，而且避免了交叉污染和气溶胶泄漏。近年来，研究人员越来越关注LAMP和微流控芯片的结合。
中国经典的LAMP微流控芯片是由CapitalBio technology设计的离心盘恒温微流控芯片。该芯片有24个检测孔，每个孔体积为1.4μL，30分钟即可获得结果。它可以实现多个指标的并行检测，大大减少了检测时间和成本。2012年，Kong等人设计了一种基于LAMP技术的便携式POCT微流控芯片，用于细菌鉴定。该芯片结构简单，在PDMS上构建微通道。通过空气等离子体与玻璃板的结合，利用毛细管虹吸效应进行试剂分配，并通过扭矩阀进行流体控制。在扩增过程中，使用65℃水浴45分钟用肉眼观察结果。还实现了用“样品输入，结果输出”及POCT鉴定细菌。2010年，蒋的团队提出了一种基于LAMP技术的用于定量检测病原体的微流控芯片，称为微LAMP（μLAMP）。该结构是具有八个锥形入口/出口通道的PDMS玻璃复合微流控芯片，可以快速灵敏地提供目标核酸的特异性和定量鉴定，满足多通道并行检测的要求。扩增反应条件是在63℃水浴中1小时，结果可以用肉眼观察并通过凝胶电泳证实。通过浊度吸光度测量，多集成光纤，数字光纤传感器和光学晶体管可以实现产品的实时定量分析。Bau的研究小组报道了一种LAMP反应器集成的隔离膜，用于POCT检测传染病。该一次性盒包括单个LAMP反应室，其中可以分离，浓缩，纯化和扩增核酸。分离膜可以捕获并消除洗脱步骤的核酸。LAMP反应器可用于检测与唾液、尿液和其他体液以及水和食物中携带的其他病原体相关的核酸。Luo等人设计了一种用于区分细菌的实时微流控多重电化学灯芯片。这种微流控系统被称为多重电化学（μME-LAMP）系统。μME-LAMP系统将LAMP和基于铟锡氧化物（ITO）电极的微流控芯片结合起来，通过测量电化学信号定性和定量分析多个基因。这有可能应用于临床诊断。Lee等人提出了一种用于数字定量DNA的微流控芯片涂覆的亲水薄膜基LAMP。这种微流控芯片不需要外部泵，并使用毛细管力驱动液体流动。该设计在POCT诊断中具有广阔的前景。LAMP技术还可用于检测食源性和水源性病原体，以确保食品和饮用水的安全。在性传播疾病的多重检测中，使用具有圆盘或蝴蝶结构的微流控芯片来提高检测通量和效率，并且这些芯片已被商业应用。基于LAMP的微流控芯片仍有许多改进之处，未来肯定会在POCT诊断领域占据一席之地。
4 纸基和混合微流控芯片
纸片具有成本低、加工简单、结构灵活、环境友好、生物相容性好等优点。微流控纸基芯片与微流控技术相结合，综合了两者的优点，是一个具有良好应用前景的发展方向。纸基微流控芯片通常使用滤纸作为基材，滤纸作为反应区或循环区进行亲水或疏水处理。纸张材料独特的三维孔结构可以提供毛细力来驱动液体流动，经过亲水处理的材料表面可以吸附试剂并在那里发生反应。另外，经疏水处理的表面有利于液体流动。常用于基材的纸张包括Whatman系列滤纸，硝酸纤维素膜滤纸，墨水纸，色谱分析纸，Kleenex纸和各种复合纸。基于纸张的微流控芯片处理方法包括光刻、蜡印、柔性版印刷、喷墨打印、3D打印和激光切割。亲水和疏水处理有一步法和两步法。一步法对所有材料表面进行一次亲水和疏水处理，两步法是指使用物理沉积、等离子体处理和其他方法对材料进行局部处理。与基于聚合物的微流控芯片不同，一些纸基微流控芯片不需要关闭，这些被称为开放通道，因为纸基微流控芯片中的液体在纸纤维内移动，这简化了微流控芯片的加工过程。此外，与聚合物，玻璃，水凝胶和其他材料相结合的混合微流控芯片整合了各种材料的优点，使芯片更加全面，这是未来微流控芯片最有前景的发展方向之一。
2006年，Wang等人设计了一种可用于DNA扩增和检测的一次性微流控装置。这是一种早期核酸检测系统，将微流控技术与横向色谱技术相结合，大大提高了检测效率。该装置引入了一种温度敏感的水凝胶阀作为控制开关，不仅可以关闭PCR室，还可以抑制气泡的形成。微流控盒的检测方法是红外激光激发荧光颗粒产生荧光。细胞裂解，DNA分离，纯化，扩增和检测的整个过程可以在单个芯片上完成，实现了对病原体和体液的一次性独立快速检测。2007年，哈佛大学Whiteside的团队首次提出了一种纸基微流控芯片，并将其用于分析代谢产物，如血糖，尿酸和乳酸。Dou等人于2016年开发了一种PDMS纸玻璃混合微流控芯片，用于检测多种病原体。该芯片有三层。PDMS的上层用于转移试剂，它包括四个微通道和一个注射口。中间层是反应区，它包括由四个微通道连接的八个孔。检测室，阴性对照腔和色谱纸也放置在中间层。纤维素纸的3D多孔结构有利于保护DNA引物免受不利的环境影响，可以有效防止气溶胶的形成，从而导致空气中引物的损失。因此，聚合物/纸基复合芯片具有更长的使用寿命。底层由玻璃碎片支撑。混合芯片的加工方法是激光切割，它快速且易于操作。键合方法是氧离子键合，以键合玻璃和PDMS。入口/出口用环氧树脂封装。副产物焦磷酸盐与锰离子结合形成络合物，钙黄绿素与锰离子结合产生荧光，可在1小时内用肉眼直接观察到。混合微流控芯片可用于检测多种病原体，具有高灵敏度和特异性，成本低，速度快，无需仪器。Yin小组将kirigami技术引入3D结构，并将二维剪纸的想法扩展到三维空间剪纸，并设计了一种具有多种变形模式的通用三维剪纸模块。李和刘利用折纸技术设计了一种三维多功能集成纸基微流控分析系统，可以实现四种肿瘤标志物的并行检测。研究人员认为，模块化设计和组装将不受尺寸和材料的限制，他们的研究有望在可重构超材料，机器人和建筑设计领域找到潜在的应用。折纸技术的引入为纸基微流控芯片的开发提供了新的思路。Li团队结合LAMP技术、微流控技术和生物传感技术，设计了一种基于光盘（CD）结构的纸聚合物混合微流控纳米传感器，用于检测脑膜炎和其他传染病。该芯片只需几十美分，大小仅为一枚硬币，可有效存储引物73天，便于后续扩增，并提高检测灵敏度和稳定性。该芯片体积小，便携，成本低，速度快，可以定量检测多种病原菌。它非常适合偏远，不发达和贫困地区，对于促进这些地区的医学诊断具有重要意义。2019年，宁博士研究小组设计的自主毛细管微流控芯片（ACMC）通过使用毛细管驱动，自聚焦透镜光学检测和定制的移动应用程序实现了POCT即时心肌梗死检测。测试结果同时传输给医院和用户。此外，在分析化学领域，还有一些纸基POCT与电化学生物传感器相结合，用于检测分泌物和生物标志物。纸基微流控芯片在POCT领域具有巨大的应用潜力。
5 微流控生物传感器
近几十年来，人们的健康意识越来越强，对某些疾病，特别是传染病的预防和诊断需求越来越高。与用于POCT诊断的微流控芯片集成的生物传感器满足了快速检测的要求，已成为研究的热点。微流控技术和先进的生物传感技术的结合导致了许多优秀的小型分析平台的发明，这些平台可以实现微/纳米液体的精确控制，并在小型平台上集成各种类型的生物阵列。这种微流控集成生物传感器装置具有许多优点，例如试剂消耗低，反应时间短，自动化样品制备，高通量分析，最小有害物质处理，平行检测，高检测精度以及灵活的设计和小型化，便携性，低成本，和一次性使用。
生物传感器技术是指能够感知或响应化学和生物信息，并将化学或生物信号转换为可根据某些规则识别的电信号或光信号的技术。POCT是一项集生物学、化学、材料、光学、微电子和其他学科于一体的先进技术。它快速，灵敏，成本低，检测设备易于自动化和小型化。POCT在医学诊断中具有广阔的应用前景。生物传感器是一种传感器，它使用生物实体作为识别元件，通过特定目标将生物信号转换为易于测量的信号，例如光，电，热，压力和质量，以检测各种生物实体。生物传感器主要包括三部分。一个由用于检测的生物实体组成，包括DNA，动植物组织，细菌，微生物，细胞，酶，抗体，蛋白质，核酸，葡萄糖，氨基酸和乳酸。第二个是检测转换器，用于检测生物信号并将其转换为其他可测量信号。第三是用于显示分析结果的显示设备和信号处理设备。生物传感器可分为两类：微阵列生物传感器和微通道生物传感器，后者是集成微流控芯片的生物传感器。此外，根据生物分子的不同，微通道生物传感器可分为核酸生物传感器、酶生物传感器、免疫生物传感器、细菌生物传感器、微生物传感器、细胞传感器和仿生传感器。根据信号检测原理的不同，微通道生物传感器可分为电化学生物传感器、光学生物传感器、热敏电阻传感器、场效应晶体管传感器、压电石英晶体传感器、质量传感器和表面等离子体共振传感器。生物传感器可用于生物分子的定性和定量分析。妊娠测试和血糖仪目前是商业上成功的生物传感器，但目前应用的大多数生物传感器都依赖实验室仪器来实现传感，不适用于POCT快速检测系统。近年来，科学家们致力于开发便携式，小型化，低成本和易于操作的生物传感器。因此，结合微流控技术和生物传感器的微流控生物传感器应运而生。集成微流控生物传感器POCT设备在临床检测、生化分析、疾病诊断、食品安全、环境监测、国防、反恐举措、生物战剂等领域具有巨大的应用潜力。它们更有效，更具体，更灵敏，更便携，更易于自动化，并易于读取结果。生物传感器的示意图和应用如图2所示。
图2生物传感器应用示意图。
Sia等人设计了一种基于光学检测的微流控生物芯片，用于诊断艾滋病毒，为偏远地区的低成本疾病预防和诊断带来了希望。克鲁克的团队将纸基微流控芯片与生物传感器相结合，利用印刷和折纸技术生产了一种用于腺苷检测的三维纸基微流控芯片生物传感器。Rushling等人使用印刷碳电极作为CD上的基板来制作PDMS微通道，并插入银和铂电极以形成用于检测血清标志物的电化学传感。还有一些关于检测生物发光细菌的研究。这些微流控生物传感器通常由含有微通道的微流控芯片，用于感测靶标的活性细胞和换能器组成。根据细菌的状态，这些研究可以分为细菌悬浮，冷冻干燥和固定类型。细菌悬浮液是指液体中处于悬浮状态的细菌，细菌冻干是指制成冻干粉末的细菌，细菌固定是指将细菌固定在一次性样品池，光纤或芯片上。例如，Eltzov小组开发的用于检测水中有毒污染物的光纤监测系统是将细菌固定在光纤上。Jouanneau等人设计了一种用于检测重金属的微流控生物传感器。如今，随着智能手机的普及，与手机集成的微流控生物传感器可以利用手机的摄影、视频、传感和蓝牙等功能，向用户和云提供实时、同步的检测结果反馈。与智能手机集成的微流控生物传感器是新一代智能生物传感器，具有巨大的市场前景。Ozcan的团队开发了一种安装在智能手机上的POCT快速检测诊断设备，该设备通过摄像头获取图像，并连接手机定制的应用程序进行同步处理。然后，它会自动输出诊断结果，并将其发送给用户和医疗机构。研究人员可以成功地使用这种设备来检测艾滋病毒/艾滋病、结核病、疟疾和各种传染病。它极大地促进了流行病的预防，监测和诊断，也为在偏远地区推广传染病的快速诊断提供了条件。
6 微流控芯片的研究进展
此外，微流控技术还被应用于疾病诊断、细菌筛选、免疫生化反应、酶蛋白识别、类器官技术等领域。2021年，由新加坡南洋理工大学侯等人开发的ExoDFF微流控芯片被用于评估糖尿病患者的血管健康。ExoDFF使用离心力和流体力学将囊泡细胞与血液分离以进行分析。与传统的血液分离器相比，ExoDFF芯片的成本仅为几元，这大大降低了检测成本。该芯片有助于患者快速监测其血管健康状况，并具有巨大的商业潜力。2021年7月，《科学》报道称，一种名为高通量微流控酶动力学（HT-MEK）的微流控玻璃芯片可以在短短几个小时内同时检测1000多种酶的突变。它的价格仅为10美元，尺寸约为7平方厘米，包含1568个微孔，每个微孔可以测试一种酶。液滴微流控技术是高通量检测常用的微流控技术之一。来自中国科学院（CAS）研究所的王蒙团队设计了一种液滴嵌入微流控技术，用于高通量筛选每小时10000株链霉菌。这项工作发表在《自然》杂志上。中国科学院深圳先进技术研究所的研究人员设计了一种微流控芯片，可以一步从全血样本中分离出高纯度的循环肿瘤细胞（CTC）和循环融合细胞（CFC），并进行高通量单细胞转录组测序。数字微流控芯片是一种高通量微流控芯片，它使用芯片上的电极阵列形成电信号来控制液滴。其原理是利用表面张力的差异来控制液滴，核心技术是如何高效稳定地产生微滴。最近，中国科学院苏州生物医学工程技术研究所的研究人员提出了一种数字微流控芯片，可以将大液滴分成三个小液滴。较小的液滴尺寸可以打破最小体积限制。该技术成功地实现了小液滴的有效分离。结合其他功能模块，开发了一种全自动数字微流控分析平台，可在10分钟内并行检测5个样品。该平台可用于免疫诊断，疾病监测，治疗指导和预后评估。研究人员设计了一种微流控平台，可以准确量化和分析单细胞凸起的形成过程，并利用微流控技术实现线粒体特异性药物的快速筛选，这将对新型抗癌药物的开发产生积极影响。这项工作发表在《分析化学》上。流体电路板与微流控装置相结合，用于自动细胞培养和精确的流体控制。用户使用这种新型模块化微流控系统具有更大的灵活性。
7 总结与展望
近年来，POCT作为体外诊断（IVD）的重要组成部分，引起了各大高校、研究机构和IVD企业的关注。微流控技术作为一种多学科技术，已经被用作POCT技术的主要实现平台，无论是从技术本身的优势还是从国家层面来看。快速，便携，高灵敏度和特异性的POCT分子诊断产品已成为市场上的新宠。微流控技术由于其快速发展而逐渐成为POCT诊断的主要手段，但也存在挑战和机遇。然而，目前大多数微流控产品都局限于科学研究的实验室阶段，市场上成熟的产品并不多。微流控技术的应用有很多问题，例如受到超高精度加工要求的限制，以及难以精确控制微纳米尺寸的液体，微通道表面改性的挑战以及如何以低成本实现快速大规模生产。成本和效率一直是需要解决的问题。经过多年的研究，越来越多的新兴技术开始应用于微流控技术，涉及新一代制造技术、芯片材料选择、放大和检测方法，以及传感等领域，如3D打印技术、LAMP技术、生物传感技术、纸基微流控芯片、基于纳米材料的微流控芯片和基于混合的微流控芯片。多种功能材料的引入使得开发多功能微流控芯片成为可能，极大地扩展了微流控芯片的应用领域。相关研究人员和从业者应抓住机遇，及时应对挑战，使微流控技术在生物医学行业大放异彩。
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