目的糖尿病是一组由于遗传因素和环境因素共同作用而导致的临床综合征,是最为常见的代谢障碍性疾病。近年来,随着人民生活水平的提高和饮食结构的变化,糖尿病的发病率逐年增加,成为仅次于高血压和肿瘤的第三大疾病。糖尿病所引起的大血管病变及微血管病变导致糖尿病人群发生糖尿病足、冠心病、视网膜病变等并发症均明显多于非糖尿病人群。此前多认为,糖尿病患者血管病变主要是由于细胞增殖过度造成,新近研究发现,正常情况下血管平滑肌细胞(VSMCs)的增殖与凋亡处于平衡状态,此平衡对于维持血管壁的功能正常尤为重要,细胞增殖与凋亡失衡是糖尿病血管病变的重要机制,尤其是血管平滑肌细胞凋亡的减少在造成血管中膜增厚中发挥更为重要的作用。本研究旨在证实与正常浓度葡萄糖培养之VSMCs相比,在高浓度葡萄糖环境下,血管平滑肌细胞的凋亡减少,细胞增殖过度,并探讨其与凋亡相关基因表达变化之间的关系。方法无菌条件下取出家兔胸主动脉,使用冷PBS溶液冲洗血管内血污以防止血细胞污染,洗净后去除血管外膜纤维结缔组织,体外组织贴块法培养中膜血管平滑肌细胞,细胞长满后使用0.25%胰蛋白酶消化传代细胞,第3代细胞用于本实验。分为正常浓度葡萄糖组(5.5mmol/L葡萄糖)、甘露醇高渗对照组(即5.5mmol/L葡萄糖 19.5mmol/L甘露醇)和高浓度葡萄糖组(25mmol/L葡萄糖),诱导72h后用于实验。实验方法包括:(1)提取细胞总RNA和总蛋白,分别用PCR法和Western blotting法检测凋亡相关基因bcl-2在三种培养环境下VSMCs中表达的情况,对比三组的组间差异。(2)流式细胞仪检测经Annexin-V/PI双染的VSMCs的凋亡率。(3)MTT比色法检测三种不同培养环境下VSMCs的增殖状况。结果(1)与正常浓度葡萄糖组(NG)相比,高浓度葡萄糖(HG)环境培养的VSMCs,其bcl-2表达增强,甘露醇对照组与NG组无统计学差异。(2)与正常浓度葡萄糖组(NG)相比,高浓度葡萄糖(HG)环境培养的VSMCs,流式细胞仪显示其早期凋亡比率降低,甘露醇对照组与NG组无统计学差异。(3)与正常浓度葡萄糖组(NG)相比,高浓度葡萄糖(HG)环境培养的VSMCs,MTT比色法显示其细胞增殖率增加,甘露醇对照组与NG组无统计学差异。结论在高浓度葡萄糖的作用下,VSMCs的抗凋亡基因bcl-2的表达增强,导致VSMCs的凋亡减少,增殖增加,从而引起糖尿病血管并发症的发生。
