目的：肠屏障可防止肠道内寄生菌、毒素等经肠壁到达肠外，它由肠道机械屏障、微生物屏障、免疫屏障、化学屏障组成。肠道免疫屏障主要由肠道M细胞、肠上皮内淋巴细胞(iIEL)、固有层淋巴细胞、分泌性IgA(SIgA)等组成。SIgA通过抑制细菌或病毒黏附在肠上皮表面，阻止细菌穿入肠道屏障。因此，肠道内SIgA存在状态影响肠道免疫屏障功能。在探讨肝坏死自发性腹膜炎(SBP)发生机制时，研究肠道SIgA变化至关重要。本研究对重型肝炎临床患者肠道SIgA进行检测，并建立急性肝坏死动物模型和体外培养肠上皮细胞，观察肠道IgA、SIgA和SC变化情况以及TNF-α和NO对肠上皮细胞分泌SC的影响，以探讨在急性肝坏死时肠道免疫屏障的变化，从而研究SBP发生机制。 材料和方法：1.对象1.1临床患者：30例重型肝炎病例为2004-2005年中国医科大学附属第二医院感染科入院患者，20例重型肝炎死亡病例的肠、肝组织由北京佑安医院和第三军医大学西南医院提供。 1.2动物模型：采用雄性Balb/C小鼠390只，随机分为八个组，即：1组：生理盐水组，2组：LPS，3组：D-GalN，4组：LPS+D-GalN，5组：D-GalN+TNF-α，6组：D-GalN+LPS+TNF-α抗体，7组：TNF-α，8组：D-GalN+LPS+TNF-R1抗体，除6、8组外每组分5个时间点(2h、6h、9h、12h和24h)，第6、8组以9h为时间点。分别取肝和肠等标本待检。 2.方法2.1分别用免疫散射比浊法和放射免疫方法检测重型肝炎患者血清和粪便中IgA、SIgA的含量。 2.2免疫组化方法检测重型肝炎患者肠、肝组织内IgA、SC(SIgA)的表达。 2.3双免疫荧光染色检测重型肝炎患者肠上皮细胞浆、膜上SIgA的表达。 2.4建立ELISA方法检测急性肝坏死动物模型血清、粪便IgA的含量。 2.5用放射免疫方法检测急性肝坏死动物模型粪便SIgA的含量。 2.6免疫组化方法检测急性肝坏死动物模型肠道IgA的分布和表达。 2.7实时定量PCR(real-timequantitativePCR)检测小鼠肠组织SCmRNA的相对含量 2.8利用免疫组化、Weasternblot、Real-timePCR方法检测TNF-α和NO对Caco-2细胞分泌SC的影响。 结果1.重型肝炎患者血清和粪便中IgA和SIgA较正常对照组明显升高(P＜0.01)。 2.免疫组化检测重型肝炎患者肠道SC和IgA：重型肝炎肠组织SC染色较正常肠组织明显减弱，甚至难见，IgA染色也明显减弱。肠道SC、IgA免疫组化光密度分析显示重肝患者肠组织SC、IgA较正常对照组明显降低(P＜0.01)。 3.肠道双免疫荧光染色显示正常肠组织肠上皮细胞浆(分泌的SC)呈橘红色，膜上SIgA呈黄色，固有层活化淋巴细胞呈橘红色或黄色；重型肝炎肠组织肠上皮细胞浆、膜染色均明显减弱。 4.LPS/GalN引起的肝坏死小鼠粪便SIgA含量升高与NS组相比均有显著差异(P＜0.01)，在9h达到高峰。粪便、血清IgA6h开始升高，维持到24h，与NS组比较有显著意义(P＜0.01)。 5.LPS引起的肝坏死小鼠肠道IgA免疫组化染色：IgA染色急性肝坏死肠组织较正常肠组织阳性明显减弱。IgA的光密度注射LPS+GalN后在2h开始下降，维持到12h，与NS组相比有显著意义(P＜0.01)。 6.LPS/GalN引起的肝坏死小鼠肠组织SCmRNA的表达：LPS引起的肝坏死小鼠在2hSCmRNA的表达量开始下降，9h达到最低，与NS组均有显著差异(P＜0.01)。 7.由TNF-α/GalN引起的急性肝坏死动物变化和死亡率与LPS/GalN类似，肝组织和肠组织病变与LPS/GalN相同，随时间逐渐加重，说明TNF-α是急性肝坏死的重要介质。 8.由TNF-α/GalN引起的急性肝坏死动物肠道免疫组化结果：IgA染色可见NS组、抗TNF-IgG组、抗TNF-R1组肠组织肠上皮细胞浆、膜和固有层活化淋巴细胞呈棕黄色强阳性，由TNF-α/GalN引起的急性肝坏死肠组织肠上皮细胞浆阳性明显减弱。IgA的光密度注射TNF-α+GalN后在2h开始下降，6h达最低维持到12h，与NS组相比有显著意义(P＜0.01)，这更证明TNF-α是急性肝坏死的重要介质。 9.由TNF-α/GalN诱导的肝坏死小鼠肠组织SCmRNA的表达：TNF-α肝坏死组中，2h、6h、9hSCmRNA的表达量均下降，9h达到最低，与NS组亦有显著差异(P＜0.01)，抗体组(抗TNF-α-IgG组、抗TNF-R1组)SCmRNA表达无明显变化。进一步证明TNF-α在肝坏死中起重要作用。 10.免疫组化染色分析Caco-2细胞表达SC：无TNF-α刺激时培养Caco-2细胞SC阳性细胞大约为0.5-0.6％，用不同浓度TNF-α刺激后SC阳性细胞明显增加，400ng/mlTNF-α刺激后SC阳性细胞达到3.0-3.5％。SC主要位于Caco-2细胞浆和细胞膜上。用不同浓度的Sin1刺激后SC阳性细胞明显下降，不同浓度的Sin1刺激后SC阳性细胞率分别为0μM0.5-0.6％、125μM0.46-0.50％、250μM0.26-0.30％、500μM0.12-0.15％、1000μM0.18-0.22％。 11.Caco-2细胞分泌SC蛋白的半定量分析：SC的分子量为80KD，结果表明在80KD位置有明显条带，加入TNF-α后蛋白表达量明显增加，与无TNF-α(即浓度为0ng/ml)刺激Caco-2分泌SC蛋白表达量相比明显升高(P＜0.01)；加入Sin1后蛋白表达量明显下降，与无Sin1(即浓度为0μM)刺激Caco-2分泌SC蛋白表达量相比明显降低(P＜0.01)。 12.TNF-α对Caco-2细胞分泌SC的mRNA相对表达量的影响：检测的mRNA通过管家基因GAPDH进行校正，随TNF-α浓度升高SC的mRNA相对表达量明显升高(P＜0.01)。加入Sin1后SC的mRNA相对表达量明显下降，与无Sin1(即浓度为0μM)刺激Caco-2分泌SC表达的mRNA相对含量相比明显下降(P＜0.01)。 结论1.重型肝炎患者血清和粪便中IgA和SIgA较正常对照组明显升高，但重肝患者肠道SC、IgA在肠上皮细胞浆内和膜上分布明显减弱。 2.重型肝炎患者肠上皮细胞浆和膜上SC、IgA表达降低，引起肠上皮细胞表面的SIgA减少，导致肠道免疫屏障损伤，引起肠道免疫防御功能减弱，可能是重型肝炎患者腹膜炎的一个原因。 3.急性肝坏死小鼠血清、粪便IgA、SIgA显著升高，但急性肝坏死小鼠IgA在肠上皮细胞浆内、膜上和固有层活化淋巴细胞分布明显减弱，与重型肝炎患者变化一致，因此急性肝坏死动物模型是研究重型肝炎肠道免疫防御的一个很好模型。 4.急性肝坏死小鼠肠上皮细胞表达的SC在分子水平明显减少，是肠上皮细胞膜上SIgA分布明显减少的原因，最终引起急性肝坏死小鼠肠道免疫屏障功能明显减弱。 5.由TNF-α/GalN引起的急性肝坏死动物死亡率和肠道SC、SIgA变化与LPS/GalN引起的急性肝坏死动物一致，说明TNF-α是急性肝坏死的重要介质。 6.TNF-α在蛋白和分子水平引起SC表达增加，因此TNF-α不是引起急性肝坏死肠道SIgA、SC下降的直接因素。 7.NO在蛋白和分子水平引起SC表达减少，NO是引起急性肝坏死肠道SC和SIgA的减少直接因素。
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