华蟾毒精抗癌作用的体外研究

 

 

 

【关键词】  华蟾蜍毒素

 

　　关键词: 华蟾蜍毒素;肝肿瘤;白血病;细胞;比色法;氮蓝四唑;流式细胞术;显微镜检查，电子，扫描透射

 

　　摘 要:目的  了解中药成分华蟾毒精（cinobufagin，cbg）的体外抗癌活性及其主要作用机制. 方法  采用流式细胞术检测华蟾毒精对体外培养的人肝癌细胞株smmc-7721、人白血病细胞株hl-60的细胞毒作用;经透射电子显微镜观察cbg作用后培养的smmc-7721及hl-60细胞超微结构的改变. 结果  华蟾毒精有显著的抗癌活性;对hl-60细胞的ic50 为1.25μg?l-1 ，对smmc-7721细胞的ic50 为2.72μg?l-1 ，能非常显著地减少hl-60，smmc-7721细胞s期dna含量及增值指数，诱导癌细胞凋亡;透射电镜观察显示:华蟾毒精作用后，可见成片的细胞坏死，细胞凋亡，内质网肿胀、线粒体肿大呈空泡样，溶酶体增多等细胞结构改变. 结论  华蟾毒精有确切的抗癌作用，其作用产生的机制是多方面的，既能抑制癌细胞dna的生物合成，又能诱导细胞凋亡.

 

 

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引言

    

　　华蟾毒精（cinobufagin，cbg）是从中药蟾酥分离出的一种单体，分子式:c26 h34 o5 ，mr442;蟾酥则是蟾蜍科动物中华大蟾蜍bufobufogargarigans gantor或黑眶蟾蜍buflmelanosliclus schneider的干燥分泌物.蟾酥具有解毒消肿，通窍止通，强心利尿等功效;凡痈疽，无名肿毒，岩肿恶疮，咽喉肿痛，外敷内服皆极有效验，现代药理研究证实蟾酥具有抗癌、抗病毒、强心、麻醉、止痛，促进骨髓增生作用［1］ ，而华蟾毒精是蟾酥有效成分，经文献检索未见有关华蟾毒精抗癌作用研究的系统报道，而我们认为华蟾毒精在抗癌方面有极为广阔的应用开发前景，有必要对华蟾毒精的抗癌作用进行系统的体外实验研究.

    

　　1 材料和方法

 

　　1.1 材料 ①人肝癌smmc-7721细胞株:是一种可连续传代的人肝癌细胞，来自我国上海一位56岁男性患者的上皮型肝癌，由第二军医大学童春荣等人于1977年建立，本实验所用的细胞株由本校口腔医学院中心实验室吴军正教授处引入.hl-60细胞系:是1977年由collins等建株的人急性髓性白血病（fab-m2）细胞株，具有多种分化潜能，依据分化诱导剂的不同，可向粒系，巨噬系及嗜酸粒细胞方向分化，是分化诱导研究的经典模型，在含100ml?l-1 小牛血清的rpmi1640培养液中呈悬浮生长，倍增时间约20h.本实验所用的hl-60细胞系由口腔医院中心实验室吴军正教授引入.阿霉素粉针剂（adriamycin.adm，批号9706532）:由药店购入，系意大利爱宝大药房生产，规格10mg/支.②cbg:中国药品生物检定所购入标准品.rpmi-1640培养基:为日本制药株式会社生产，购于华美生物工程公司，加100ml?l-1 小牛血清及青霉素100u?l-1 .mtt:瑞士fluka公司生产，黄色结晶，以10ml?l-1磷酸缓冲溶解，在4℃冰箱避光储存.小牛血清:购自华美生物工程公司，co2 孵箱:美国forma scientifi公司产品.倒置显微镜:日本olympus公司.超净工作台:苏州净化设备厂.隔水式电热恒温培养箱:上海跃进医疗器械厂.fgl-16g高速台式离心机:上海安宁科学仪器厂.光学显微镜:日本olympus公司.dg3022-ⅱ型酶联免疫检测仪:华东电子管厂.混合振荡仪:上海医疗器械厂.

    

　　1.2 方法 mtt法测定ic50 :①选用对数生长期的贴壁肿瘤细胞，用胰酶消化后，用含100ml?l-1 小牛血清rpmi1640培养液配成5×105 个?l-1 的细胞悬液，接种在96孔培养板中，每孔接种200μl，37℃，50ml?l

-1 co2 培养24h.②实验组换新的含不同浓度被测样品的培养基，对照组换含同种溶剂的培养基，每组设3排平行孔，37℃，50ml?l-1 co2 培养.③弃去上清液，每孔加入200μl新鲜配制的含0.2g?l-1 mtt的无血清培养基，37℃继续培养4h.小心弃上清，并加入200μl dmso溶解mtt甲月替沉淀，用微型超声振荡器混合匀后，在酶标仪上以试验波长为570nm，参比波长为450nm测定光密度值.

   

　　结果评定:按下式计算药物对肿瘤细胞生长的抵制率.

 

　　肿瘤细胞生长抵制度%=（1-实验组光密度值对照组光密度值）×100%以同一样品的不同浓度对肿瘤细胞生长抵制率 作图可得到剂量反应曲线，从中求出样品的半数杀伤浓度ic50 .合成化合物或植物提取纯品的ic50 <10mg?l-1 ，或植物粗提物的ic50 <20mg?l-1 时，则判断样品在体外对肿瘤细胞有杀伤作用.

 

　　采用流式细胞仪观察华蟾毒精对二种不同癌细胞周期及dna含量的影响.①取对数生长期细胞，作活细胞计数，用含100ml?l-1 小牛血清的rp-mi1640培养液配成1×109 个?l-1 细胞悬液，分装在培养瓶中，对照组加入等体积的rpmi1640培养液，实验组加入一定体积的药物（见下文），置含50ml?l-1 co237℃饱和湿度孵箱中培养16h.②离心收集细胞，pbs洗2次，离心弃去pbs，用剩余的pbs充分混匀细胞，加入冰冷的700ml?l-1 乙醇，混匀，用封口膜封口，4℃过夜.③700ml?l-1 乙醇pbs洗2次，用剩余的约0.5ml pbs混匀固定细胞，加入rnaasea（终浓度为50mg?l-1 .37℃消化1h）.④加入碘化丙啶（propidiumiodide，pi）终浓度为30ml?l-1 ，4℃染色1h.⑤上机.在coulter公司生产的epies profileⅱ流式细胞仪（fcm）上测定，氩离子激光光源功率250mw，波长488nm.每批样本测档臆用鸡红细胞调节仪器，采用多参数细胞分析软件（multicyclesoftware coulter公司提供）拟合处理，对样本进行dna含量及细胞周期分析.

 

 

　　实验共分3组:①对照组:正常培养加入相同体积的rpmi1640培养液;②阿霉素组:adm;③华蟾毒精组:cbg.上述各组均取ic50 为药物浓度.

 

　　透射电子显微镜观察比较华蟾毒精对癌细胞的形态影响.①细胞收集:取对数生长期的单层生长细胞，弃去瓶中培养液用低浓度胰蛋白酶消化，用吸管将细胞移入10ml尖底离心管中，加4℃预冷的pbs（0.01mol，ph7.2）至10ml并用吸管轻轻吹打均匀，然后以2000r?min-1离心15～20min，吸弃上清液，置冰浴杯中备用.悬浮生长细胞可直接离心，本法均需细胞量5×106 个.②固定:取离心管并倾斜一定的角度，用吸管沿管壁缓缓加入4℃预冷的45ml?l-1 戊二醛4ml，在4℃固定30min～2h.然后采用探针拨离细胞团块，移入青霉素小瓶中，在4℃用pbs漂洗3次.脱水:用系列丙酮在温室下脱水.500ml?l-1 丙酮溶液，1次，10min.700mg?l-1 丙酮溶液，1次，10min.900mg?l-1丙酮溶液，2次，每次10min.1000mg?l-1 丙酮溶液，3次，每次10min.③浸透:吸弃瓶中脱水剂，加3ml纯丙酮-epon812包埋剂（1∶1体积比），室温下放置30min后，弃去稀释的包埋剂，加纯包埋剂1ml.室温下放置2h.④包埋:细胞团块;吸取混合包埋剂滴2滴于2号胶囊模块孔的底部，把细胞团块移入胶囊底部中心，注满混合包埋剂，放60℃烤箱烘24h，使之固化成硬块.⑤修块，超薄切片，枸橼酸铅，醋酸钿双重染色，日本产jem-2000ex电镜下观察.

    

　　2 结果

    

　　mtt法测定结果表明:化蟾毒精对hl-60ey smmc-7721细胞均有杀伤作用，其半数杀伤浓度ic50 见tab l.流式细胞仪检测体外培养的人白血病细胞系hl-60，人肝癌细胞系smmc-7721细胞在华蟾毒精作用后，细胞dna含量、细胞同期分布，增殖指数的变化及无明显凋亡峰出现的情况见tab2，3.

    

　　表1 华蟾毒精对hl-60和smmc-7721细胞的半数杀伤浓度　略

         

　　表2 hl-60系fcm分析结果　略

        

　　表3 smmc-7721系fcm分析结果　略

         

　　华蟾毒精对hl-60及smmc-7721细胞以ic50 量作用20h后透射电镜超微结构观察结果显示:对照组癌细胞呈多边形，核大、多核，核仁明显，核分裂相多见，胞质内糖元，脂滴丰富，内质网、线粒体、核糖体发达，胞膜上有较多数目微绒毛;adm组见可少量细胞器变性，细胞坏死;cbg组，可见细胞核及细胞器同时损伤，内质网肿大、线粒体肿大呈气球样，溶酶体增多及细胞核固缩、碎裂及溶解，成片坏死细胞，大量的凋亡细胞，在二种细胞中以hl-60细胞尤为典型.

    

　　3 讨论

    

　　华蟾毒精是中药蟾酥中有效抗癌成分，蟾酥属中药中剧毒药，用蟾酥抗癌是依据“以毒攻毒”治疗原则，临床用以治疗癌肿，至少有近千年历史，现代临床研究资料表明蟾酥治疗肝癌、胃癌、食道癌效率达50%～70%，同时有刺激骨髓增生，有效防止放疗、化疗引起的白细胞下降，不仅能提高放疗、化疗的治疗效果，还能增强机体对放疗、化疗的耐受性，在适宜剂量内，毒性极小.唯一难题是，蟾酥是上百种成分的混合物，难以进行深入的作用机制研究［2］ ，而华蟾毒精则是单体，分子式，结构式清楚，可惜的是国内外很少有人对华蟾毒精进行系统深入的抗癌实验研究，若有与蟾酥相同的抗癌作用，应有更为广泛的开发应用价值［3-6］ .实验结果表明，用极小量的cinobufagin就对smmc-7721和hl-60细胞有显著的生长抑制作用，mtt检测结果表明cinobufagin对dl-60的ic50 是1.25μg?l-1 ，约为adm的1/5;对smmc-7721的ic50 是2.72μg?l-1 ，约为adm的1/2，在临床上一般蟾酥的最大用量是30mg，是cinobufa-gin的24000倍，从此可见cbg对癌细胞的生长抑制作用十分显著，用ic50 剂量的药物可以导致hl-60及smmc-7721细胞显著损伤，导致细胞大量的坏死和凋亡.从流式细胞术透射电镜结果分析，cinob-ufagin对hl-60细胞的凋亡细胞占总数的93.6%，诱导smmc-7721细胞59.5%凋亡;透射电镜则在cbg作用后的细胞超微结构中发现了典型的凋亡细胞，凋亡小体及坏死细胞，说明cbg有极好的诱导肝癌细胞smmc-7721及白血病细胞hl-60凋亡的作用.至目前为止，我们知道细胞的死亡，除了坏死（necrosis）以外，还有另一种类型的死亡，即程序性细胞死亡（programmed cell death，pcd）.程序性细胞死亡不仅是一种特殊的细胞类型，而且具有重要的生物学意义及复杂的分子生物学机制.凡能诱导癌细胞凋亡的药物，不仅意味着该药具有抑制癌肿生长的作用，还意味着该药具有诱导细胞分化的潜能，这是因为程序性细胞死亡，又称为细胞凋亡（apopto-sis），是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序性死亡.

 

 

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与细胞的坏死不同，程序性细胞死亡不是一种被动过程，而是一种主动过程，它涉及一系列基因的激活，表达以及调控等作用.它并不是病理重要依据下自体损伤的一种现象，而是为更好地适应生存环境而主动采取的一种死亡过程.

 

　　从程序性细胞死亡的角度来看，肿瘤之所以发生不是因为细胞生长过快，而是细胞死亡太慢造成的不平衡结果［7］ .

 

　　一般认为恶性转化的肿瘤细胞，是因为获得失控的生长特性，过度增殖、形成肿瘤.从程序性细胞死亡的角度来看，则认为是肿瘤细胞的程序性细胞死亡机制受到抑制，不能正常地进行细胞死亡清除的结果.肿瘤细胞中有一系列癌基因被激活，并呈现表达状态.这些基因的激活和肿瘤的发生、发展之间有着极为密切的关系.这些癌基因及其表达产物也是程序细胞性细胞死亡的重要调节因子，许多种类的癌基因表达以后，即阻断了肿瘤细胞的程序性死亡过程，使肿瘤细胞数目增加，形成肿瘤.

 

　　电镜观察结果提示:华蟾毒精对癌细胞的损伤是多部位，多途径的，其较为深入的确切机制，值得进一步研究［8-10］ .

 

　　参考文献:

    

　　［1］yang cl.a directions for use oftoxic and violence traditional chinese medicine in ancient and modern times ［m］.beijing:zhongguo yiyao chubanshe（press of china on medicine and pharmacy），1991;152-167.

 

    ［2］yin j，guo lg.modemstudy and the clinical use of tranditional chinese medicine ［m］.beijing:xueyuan chubanshe（xueyuan press），1994;895-906.

 

    ［3］li nb，zhanggm.pharmacological action and application of arailable anlitamor composition ofchinese medicine ［m ］.haerbin:heilongjiang kexue jishuchubanshe（haerbinscience and technology publishing house of heilong jiang province），1998:294-295.

 

    ［4］jin xc.advance on chemistry-and pharmacology study of ve-nenumbufonis ［j ］.（shenyang yaoxueyuan xuebao）j shenyang pharma collegy，1989;128（3）:204-211.

 

    ［5］yang lh，zhang hz，zhang b.studies on the chemical con-stituents from the skin of bufogargarizans cantor ［j］.yao hsuehhsueh pao，1992;27（9）:679-683.

 

    ［6］zhang in.induction by bufalin of dotterentiation of human leukemiacells hl-60u937 and ml1 toward macrophage/mono-cyte-like cells and its potentsignergistic effect an eltterenliation of human leulaemia cells in combinationwith other inducers ［j］.cancer res，1995;15（3）:1147-1153.

 

    ［7］fonlana ja，sun fj，rishi ak.overexpression of bcl-2or bcl-xl faits to inhibit apoptosis mediated by novelrelionoid ［j］.on-col res，1998;10（6）:313-324.

 

 

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