基因工程【学案】

知识点1

温故知新

1．如何利用高杆抗病和矮杆不抗病植株获得矮杆抗病植株？

2．基因重组？

3．生殖隔离？

4．DNA分子结构？

5．DNA复制特点？

6．基因表达？

知识点2

基因工程的概念

基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，定向赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术或基因拼接技术。属于基因重组，能够打破生殖隔离

知识点3

基因工程存在的基础

1．DNA双螺旋结构使目的基因和运载体能够结合

2．所有生物共用一套密码子，使目的基因能在受体细胞中成功表达

知识点4

基因工程的基本工具

1．“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶）

（1）来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的

（2）功能：能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列（回文序列；中心对称），并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，具有高度专一性。识别处如果发生基因突变，则该酶不再识别。大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成。

（3）切割结果：中心轴线两侧切开——黏性末端、中心轴线处切开——平末端

2．“分子缝合针”——DNA连接酶

种类

E·coliDNA连接酶

T4 DNA连接酶

来源

大肠杆菌

T4 噬菌体

区别

只能连接黏性末端

能连接黏性末端和平末端，但连接平末端的效率较低

相同点

催化缝合双链DNA片段的磷酸二酯键

【提醒】DNA聚合酶的特点是只能按照模板信息，将单个脱氧核苷酸加到已有的核苷酸片段的3'端，形成磷酸二酯键。

3．“分子运输车”——基因进入受体细胞的载体

（1）载体具备的条件：a．能在受体细胞中自我复制或整合到染色体DNA上,随染色体DNA同步复制b．具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入c．具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择

（2）最常用的载体：人工改造过的质粒，它是一种裸露的、结构简单、独立于细菌染色体之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。酵母菌也有。

（3）其它载体：λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等

知识点5

基因工程的基本操作程序

第一步：目的基因的获取

1．目的基因主要是指：编码蛋白质的结构基因

2．方法：

（1）从已有物种细胞的DNA中直接分离出来：主要用于原核生物基因的分离（基因组文库）

（2）人工合成

①反转录法（无内含子，无非编码区，需逆转录酶）→部分基因文库，如cDNA文库

②化学直接合成法（基因小，序列已知；蛋白质→mRNA→DNA）

③PCR技术扩增目的基因（在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术，2n ）

3．基因文库：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存和扩增，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因。基因文库可大可小，如果它包含了一种生物所有的基因，就叫基因组文库；如果它只包含一种生物的一部分基因，就叫部分基因文库，如互补DNA文库。从基因文库中得到目的基因的具体方法：根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物mRNA以及基因翻译产物蛋白质等特性信息来获取目的基因。

4．PCR技术

（1）原理：DNA双链复制

（2）过程：第一步：加热（替代解旋酶）至90～95℃DNA变性解链；第二步：冷却复性到55～60℃，引物（根据已知目的基因的核苷酸序列合成的核酸片段）与单链DNA互补结合；第三步：加热至70～75℃，热稳定DNA聚合酶从引物起始进行互补链的延伸。

第二步：基因表达载体的构建（核心）

1．目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，可以遗传给子代，使目的基因能够表达和发挥作用。

2．基因表达载体的组成：目的基因＋运载体(启动子＋终止子＋标记基因+复制原点)

（1）启动子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质。具组织特异性

【思考】与起始密码子的区别。

（2）终止子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端。

【注意】区别终止密码子。

（3）标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素抗性基因

3．影印培养法：同一种限制酶切割运载体和目的基因后加DNA连接酶有三种连接：目的基因自连、运载体自连、目的基因和运载体相连

第三步：将目的基因导入受体细胞

1．转化的概念：是目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。

2．常用的转化方法

（1）导入植物细胞：采用最多的方法是农杆菌转化法，其次还有基因枪法和花粉管通道法等。受体细胞一般是体细胞。

（2）导入动物细胞：最常用的方法是显微注射技术。使用显微注射仪。受体细胞多是受精卵。

（3）导入微生物细胞：原核生物具有繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少等，故早期基因工程都用原核生物作为受体细胞，最常用的原核细胞是大肠杆菌，其转化方法是：先用Ca2+处理细胞，使细胞处于能吸收周围环境DNA的生理状态，再将重组质粒溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下细胞吸收DNA分子完成转化。

第四步：目的基因的检测与鉴定

1．转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因，方法是DNA分子杂交技术。探针：用放射性同位素标记的目的基因。原理：碱基互补配对原则

2．目的基因是否转录出了mRNA，方法是DNA―mRNA分子杂交技术，即用标记的目的基因作探针与mRNA杂交。

3．目的基因是否翻译成蛋白质，方法是从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原—抗体杂交。

上述三步是分子检测，成功的标志是出现杂交带

4．个体生物学水平的鉴定。如用接种实验确定转基因抗虫植物是否出现抗虫性状。

知识点6

基因工程的应用

1．植物基因工程：抗虫、抗病、抗逆转基因植物，改良植物的品质

2．动物基因工程：提高动物生长速度、改善畜产品品质、用转基因动物生产药物（乳腺生物反应器、作器官移植供体

3．基因工程制药：

4．基因治疗：把正常的外源基因导入病人体内，使该基因表达产物发挥作用，是治疗遗传病最有效的手段，包括体内基因治疗和体外基因治疗。

知识点7

蛋白质工程

1．概念：蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种自然界原来没有的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求，又称为第二代基因工程。

2．蛋白质工程崛起的缘由：基因工程只能生产自然界已存在的蛋白质

3．蛋白质工程设计基本途径：从预期的蛋白质功能出发，设计预期的蛋白质结构，推测应有的氨基酸序列，找到相对应的脱氧核苷酸序列（基因）。

【思考】根据已知条件如何选择限制酶？完全切割和不完全切割的区别？不同的组织构建的cDNA文库相同吗？